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Communications Biology volume 6, Article number: 217 (2023) Citer cet article

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La mécanique tissulaire détermine l'homéostasie tissulaire, le développement et la progression de la maladie. La vessie s'appuie fortement sur ses propriétés mécaniques pour remplir sa fonction physiologique, mais celles-ci sont mal dévoilées dans des conditions normales et pathologiques. Ici, nous caractérisons les empreintes mécaniques à l'échelle microscopique des trois couches tissulaires qui composent la paroi vésicale saine et identifions les modifications associées à l'apparition et à la progression de conditions pathologiques (c'est-à-dire la cystite actinique et le cancer de la vessie). Nous utilisons deux instruments basés sur l'indentation (un microscope à force atomique et un nanoindenteur) et comparons les cartes micromécaniques avec une analyse histologique complète. Nous constatons que la paroi vésicale saine est un tissu mécaniquement inhomogène, avec un gradient de rigidité croissante de l'urothélium à la lamina propria, qui diminue progressivement en atteignant la couche externe du muscle. Le raidissement des tissus fibreux est corrélé à un dépôt accru de matrice extracellulaire dense dans la lamina propria. Une augmentation de la compliance tissulaire est observée avant l'apparition et l'envahissement de la tumeur. En fournissant une enquête micromécanique à haute résolution de chaque couche de tissu de la vessie, nous décrivons l'hétérogénéité mécanique intrinsèque des couches d'une vessie saine par rapport aux altérations des propriétés mécaniques associées à la cystite actinique ou à la tumeur de la vessie.

L'élasticité et la viscosité caractérisent les propriétés mécaniques des tissus mous et jouent un rôle essentiel dans la définition des fonctions cellulaires et tissulaires, ainsi que dans le développement tissulaire, la progression de la maladie et l'homéostasie tissulaire1,2,3. Chaque organe spécifique a des propriétés mécaniques particulières, qui sont altérées lorsque l'homéostasie est perturbée et que des maladies se développent, comme c'est le cas pour les processus de vieillissement, le cancer, la fibrose, les maladies cardiovasculaires et le diabète4,5,6,7,8.

La vessie est un organe creux qui doit s'adapter et s'étirer pendant le remplissage et la miction, dont les fonctions sont réalisées par des cycles de relaxation mécanique et de contractilité. Les propriétés mécaniques de la vessie ont été rapportées à l'échelle macro9,10, y compris la caractérisation des différentes zones macroscopiques11. L'altération des propriétés mécaniques de la vessie entraîne un dysfonctionnement de son rôle physiologique, comme pour de nombreuses pathologies bénignes de la vessie qui évoluent de la formation d'une matrice plus rigide à une structure plus compliante12. Un raidissement a été rapporté pour les maladies malignes de la vessie, qui se sont révélées être associées à une teneur élevée en fibres de collagène dans l'ECM 13 ; de plus, un raidissement supplémentaire de la vessie a été signalé chez les patients atteints d'une tumeur récidivante14. Bien que ces études sur des échantillons cliniques soient très informatives, elles montrent des mesures à grande échelle et un instantané de la situation clinique.

Cette étude a porté sur deux pathologies de la vessie : la cystite actinique et le cancer urothélial de la vessie. La cystite actinique est un état pathologique, qui peut être causé comme une séquelle de la radiothérapie pelvienne, couramment utilisée pour traiter le cancer de la prostate et du rectum15,16. La cystite actinique est causée par l'accumulation de protéines ECM due à une inflammation chronique, entraînant des cicatrices et un épaississement des tissus et potentiellement une défaillance organique en phase terminale, avec un impact cliniquement pertinent sur les patients4.

Le cancer de la vessie est le neuvième cancer le plus répandu dans le monde17. Il provient principalement de l'urothélium et, selon l'invasion des différentes couches tissulaires, il est classé comme cancer de la vessie non invasif musculaire (NMIBC) et cancer de la vessie invasif musculaire (MIBC). Selon le système de classification TNM18, les NMIBC sont subdivisés en pTa et carcinome in situ (Tis) lorsque la tumeur est présente dans l'urotelium, et en pT1 lorsqu'elle envahit la lamina propria. Inversement, les MIBC sont séparés en pT2 lorsque la tumeur atteint la couche musculaire, à partir de laquelle elle peut ensuite migrer en envahissant les tissus périvésicaux (stade pT3) et les organes contigus (stade pT4), incluant ainsi la prostate, l'utérus et autres19. La capacité des cellules cancéreuses à envahir les tissus adjacents est une caractéristique du cancer et, dans le cas du cancer de la vessie, l'invasion de la lamina propria20 ou de la couche musculaire21 détermine une prise en charge différente. Les cellules cancéreuses de la vessie provenant de l'urothélium envahissent le tissu sous forme de cellules individuelles isolées, de cordons de cellules en file indienne ou de petits nids22. La plupart des patients atteints de NMIBC connaissent une rechute de la tumeur et subissent donc plusieurs cycles d'intervention représentés par la résection trans-urétrale de la tumeur de la vessie (TURBT) et un traitement adjuvant intravésical20. Finalement, si la tumeur progresse et envahit également la couche musculaire, les patients peuvent être candidats à une cystectomie radicale ou à des traitements agressifs multimodaux pour tenter d'épargner l'organe21.

Les techniques d'imagerie clinique peuvent détecter la fibrose établie et les stades initiaux de la tumeur, mais il existe un besoin clinique d'identifier des stades encore plus précoces de la maladie et de développer un suivi plus personnalisé de la maladie, afin d'identifier les tout premiers signes de toute rechute de la maladie.

Comprendre le lien entre les caractéristiques micromécaniques et les phénotypes cliniques dans les tumeurs malignes de la vessie peut contribuer à améliorer la classification pronostique6. De plus, ces connaissances peuvent contribuer au développement de nouvelles thérapies basées sur la modification des moteurs micromécaniques de la cancérogenèse6. De plus, une compréhension approfondie des caractéristiques mécaniques d'une vessie saine peut être cruciale pour tout objectif de reconstruction de la vessie, dans le but de développer des vessies artificielles et mécaniquement conformes15,23.

Motivés par la perspective à long terme d'exploiter le phénotypage mécanique des cellules et des tissus comme outil de diagnostic précoce de l'apparition et de la progression de maladies telles que le cancer urothélial de la vessie, nous avons effectué des mesures de force par rapport à l'indentation pour caractériser le module d'élasticité de Young (YM). des tissus de la vessie, résolus spatialement à l'échelle microscopique. Comme l'identification des marqueurs mécaniques des maladies doit reposer sur des protocoles simplifiés et une instrumentation à réaliser en clinique, notre stratégie a été de partir d'une technique largement utilisée en mécanobiologie, à savoir la microscopie à force atomique (AFM) comme référence ; puis d'évoluer vers l'utilisation d'un nanoindenteur, qui est un dispositif d'indentation plus pratique et potentiellement facilement transférable aux cliniques pour la matière molle.

Par conséquent, le projet actuel visait à i) caractériser les propriétés élastiques statiques des trois couches tissulaires composant la paroi vésicale saine à l'échelle microscopique ; ii) identifier les modifications associées à l'apparition et à la progression d'états pathologiques (c.-à-d. cystite actinique et cancer de la vessie); et, iii) associer ces empreintes digitales mécaniques à l'étalon-or du diagnostic (c'est-à-dire l'examen histologique par un uro-pathologiste expérimenté).

L'élasticité de la vessie murine a été mesurée par deux instruments de microindentation : AFM et nanoindenteur. La paroi vésicale s'est avérée mécaniquement inhomogène, avec des valeurs de couverture locales de YM allant de quelques kPa à des centaines de kPa (Fig. 1a, b). Pour identifier l'origine de cette inhomogénéité mécanique, nous avons recherché l'existence d'une association entre la distribution YM et les différentes couches anatomiques de la paroi vésicale. Lors de l'exécution d'une indentation basée sur l'AFM focalisée sur les couches de tissu unique (Fig. 1a), il a été observé que l'urothélium avait une valeur médiane de YM de 16 kPa, la lamina propria de 63 kPa et le muscle de 72 kPa (4.20, 4.80 et 4.86 respectivement en Log10(YM/Pa)). Dans les cartes micromécaniques spatialement résolues acquises à l'aide du nanoindenteur, nous avons observé que la paroi vésicale saine était caractérisée par un gradient de rigidité tissulaire (Fig. 1b) : l'urothélium présentait le YM le plus bas (10 kPa), qui augmentait progressivement en atteignant le deuxième tissu vésical. couche, la lamina propria (100 kPa), et a diminué de manière transitoire en atteignant la couche de tissu musculaire externe (70 kPa) (Fig. 1b). Les instruments AFM et nanoindenteur ont fourni des valeurs YM comparables pour les différentes couches de tissu de la vessie, à la fois en physiologie (Fig. 1c) et en pathologie (pour une comparaison complète de chaque état physiologique et pathologique et des trois couches tissulaires entre le nanoindenteur et l'AFM, le lecteur est référé à la Fig. 1 supplémentaire). Par conséquent, les résultats suivants proviennent de données recueillies en double en utilisant à la fois l'AFM et le nanoindenteur.

a YM par AFM représenté en logarithme en base 10 (log10) en Pa pour les différentes couches de tissu vésical. b Valeurs YM obtenues avec le nanoindenteur. L'hétérogénéité mécanique de la vessie est en corrélation avec sa distribution anatomique : il existe un gradient de YM, l'urothélium étant la couche la plus molle, avec une rigidité croissante lorsqu'elle atteint la lamina propria, puis décroissante sur les couches musculaires. L'association des gradients de rigidité avec les couches de tissu anatomique de la vessie est illustrée par la superposition de la carte mécanique avec la coloration à l'hématoxyline-éosine. Les pixels bleus indiquent les mesures rejetées. c Moyenne des valeurs médianes d'une paroi vésicale de rat sain ± SEM, extraites par les deux instruments. L'AFM et le nanoindenteur fournissent des résultats comparables (le test Anova à 2 voies n'a montré aucune différence statistiquement significative). Pour une comparaison complète entre le nanoindenteur et l'AFM, le lecteur est renvoyé à la Fig. 4 supplémentaire. d Évolution de la rigidité des différentes couches de tissu vésical (urothélium, lamina propria et muscle) avec le vieillissement de l'animal adulte (AFM et nanoindenteur données rassemblées). La distribution des valeurs YM pour l'ensemble du tissu (c'est-à-dire toutes les couches ensemble) est également indiquée. N = 3 rats par point de temps, chaque couche de tissu de chaque rat unique est caractérisée par plus de 3000 mesures de courbe de force. Les données présentées sont des logarithmes en base 10 de YM (en Pa). e Moyenne des valeurs médianes de chaque rat ± SEM. Le test de Mann-Whitney non paramétrique n'a montré aucune différence statistiquement significative lors de la comparaison des différentes couches de tissu aux points temporels étudiés. f Quantification de la zone de la vessie qui exprime le collagène de rats témoins à différents moments ; chaque symbole représente la mesure dans une tranche de tissu, avec plusieurs tranches mesurées pour chaque vessie, chez trois animaux. Les données sources derrière les graphiques et les diagrammes peuvent être trouvées dans https://figshare.com/projects/Micro-mechanical_fingerprints_of_the_rat_bladder_change_in_actinic_cystitis_and_tumor_presence/158222.

Afin de fournir une comparaison précise de la mécanique de la vessie au cours de la progression de la maladie dans le modèle de rat versus des animaux sains, nous avons ici caractérisé l'évolution de la vessie saine YM tout au long du processus de vieillissement des animaux au cours de leur vie adulte (c'est-à-dire à partir de 4 mois, ce qui équivaut à 2 mois post-traitement, à 8 mois, ce qui correspond à 6 mois post-traitement). Le vieillissement des animaux au cours de leur vie adulte a entraîné un raidissement global du tissu vésical (Fig. 1d). Fait intéressant, en se concentrant sur chaque couche de tissu, une telle tendance a été confirmée. En effet, l'urothélium présentait une très large distribution de valeurs, qui s'est déplacée vers des valeurs plus élevées avec l'âge : au mois 2, nous avons pu apprécier que l'urothélium présentait une distribution bimodale, qui s'est déplacée vers des valeurs plus élevées au mois 6, et la population plus rigide s'est enrichie. On a pu observer que le pic le plus élevé des distributions d'urothélium chevauchait le pic de la lamina propria, indiquant que les limites entre les différentes couches tissulaires sont divisées par des transitions de rigidité, plutôt que par des limites tissulaires drastiques et bien séparées.

De même, la lamina propria a suivi la même tendance : au mois 2, la moyenne des valeurs médianes était de 4,72 ± 0,2 Log10(YM/Pa), jusqu'à 5,18 ± 0,25 Log10(YM/Pa) au mois 6 (Fig. 1e). De même, YM a augmenté avec l'âge également pour le tissu musculaire, et au mois 6, il a présenté une distribution bimodale. Une telle augmentation de la rigidité n'était pas corrélée à une augmentation du collagène dans le tissu de la vessie (Fig. 1f).

Des animaux irradiés aux rayons X développant une cystite actinique ont été utilisés comme modèle pour caractériser les empreintes mécaniques du tissu fibrotique de la vessie (Fig. 2a). L'irradiation aux rayons X a entraîné une augmentation de la fréquence des mictions et une diminution du volume d'urine à chaque miction (Fig. 2 supplémentaire). Cet effet biologique s'accompagnait d'altérations de l'élasticité : cystite actinique induite par l'irradiation en conséquence de la fibrose vésicale et d'un dépôt plus dense de MEC, qui d'une part entraînait une augmentation de la rigidité de la paroi vésicale, mais d'autre part le gradient d'élasticité au sein de la vessie. la paroi de la vessie a été maintenue (l'urothélium était caractérisé par le YM le plus bas, qui augmentait sur la lamina propria et diminuait davantage lorsqu'il atteignait la couche musculaire externe) (Fig. 2b).

a Représentation schématique de l'expérience : La radiothérapie aux rayons X est utilisée pour induire une cystite actinique sur la vessie. Les rats sont sacrifiés à différents moments et l'élasticité des tissus des fourmis est évaluée. b Gradient représentatif de rigidité de la paroi de la vessie collecté avec le nanoindenteur au mois 4 : les rayons X provoquent un raidissement de l'ensemble de la paroi de la vessie par rapport aux animaux sains non traités. Les différences spatiales mécaniques au sein de la vessie fibreuse sont maintenues et associées aux différentes couches tissulaires (U : urothélium, L : lamina propria, M : muscle). c Cinétique de YM à partir de vessies rayonnées par rayons X à différents moments (rouge) et comparaison avec des animaux sains du même âge (gris) mesurés à la fois avec le nanoindenteur et l'AFM. N = 3 rats par point de temps et condition, chaque couche de tissu de chaque rat a été caractérisée par plus de 3000 mesures de courbe de force. Les données présentées sont des logarithmes en base 10 de YM (en Pa). d Pli de variation de la moyenne des valeurs médianes de log10 YM des couches tissulaires des rats traités par rapport aux rats témoins appariés selon l'âge. Le test T a montré un raidissement statistiquement significatif par rapport aux animaux témoins (la moyenne ± l'écart type avec l'erreur propagée est indiqué. ns = non significatif, * = valeur p < 0,05, ** = valeur p < 0,005). e Moyenne des valeurs médianes log10 YM des couches tissulaires de chaque rat ± SEM. L'Anova à 2 voies n'a montré aucune différence statistiquement significative dans la cinétique du développement de la fibrose. f) Quantification de la zone de la vessie qui exprime le collagène de rats témoins et d'animaux irradiés aux rayons X à différents moments ; chaque symbole représente la mesure dans une tranche de tissu, avec plusieurs tranches mesurées pour chaque vessie, chez trois animaux. Les données sources derrière les graphiques et les diagrammes peuvent être trouvées dans https://figshare.com/projects/Micro-mechanical_fingerprints_of_the_rat_bladder_change_in_actinic_cystitis_and_tumor_presence/158222.

Pour caractériser la cinétique du YM après irradiation, l'élasticité de la vessie des animaux irradiés à différents moments après le traitement a été analysée et comparée à celle d'animaux sains du même âge. Deux mois après le traitement, l'urothélium était le composant tissulaire qui répondait le plus à l'irradiation, comme cela est mis en évidence à la fois en comparant la distribution de l'histogramme des données (Fig. 2c), ainsi que le changement de pli de la moyenne par rapport aux témoins (Fig. .2d). La lamina propria a montré une distribution légèrement plus étroite par rapport aux témoins du même âge (Fig. 2c), ainsi qu'un dépôt de collagène accru par rapport aux animaux témoins (Fig. 2f). La couche musculaire n'a pas montré de différences à ce moment.

Quatre mois après le traitement par irradiation, l'urothélium présentait une large dispersion de modules comparable au témoin du même âge (Fig. 2c). En revanche, la lamina propria et les couches musculaires semblaient particulièrement sensibles au processus fibrotique : en effet, les deux semblaient plus rigides et plus étroitement réparties que leurs homologues sains (Fig. 2c). De même, des valeurs moyennes plus élevées ont été observées par rapport au point de temps précédent (Fig. 2e). Lorsque l'on compare la moyenne des valeurs médianes des distributions à des homologues sains, la lamina propria et le muscle étaient plus rigides (Fig. 2d), raidissement associé à un dépôt accru de collagène sur les vessies fibrotiques (Fig. 2f).

Lors de la comparaison du profil YM du mois 4 au mois 6, les distributions ne se sont pas déplacées de manière significative vers des valeurs YM plus élevées (Fig. 2c), ce qui suggère que les dommages restent stables dans le temps et ne provoquent pas de raidissement ultérieur (Fig. 2e ). En effet, en raison du vieillissement physiologique de la vessie qui entraîne un raidissement, les différences entre les animaux irradiés et sains étaient moins drastiques chez les animaux plus âgés, car l'effet du traitement était probablement masqué par le vieillissement des animaux et le raidissement n'était signalé que pour l'urothélium (Fig. 2d). La quantification du collagène dans les tissus des animaux irradiés a montré une augmentation du dépôt de collagène par rapport aux animaux non traités aux mois 2 et 4, mais pas au mois 6 (Fig. 2f). Néanmoins, les animaux traités plus âgés présentaient une distribution moins large, suggérant que la diminution de l'hétérogénéité de la rigidité était causée par le remplacement par le collagène des composants tissulaires en raison d'une réponse fibrotique.

De manière intéressante, nous avons observé que le profil micromécanique de l'un des animaux irradiés ne montrait aucun effet en termes de raidissement, et il était comparable à ceux des animaux témoins sains du même âge (4 mois après le traitement) (Fig. 3a). Après avoir suivi l'analyse histologique et l'évaluation de la fibrose, nous avons confirmé que cet animal spécifique n'avait pas développé de fibrose vésicale (Fig. 3b), soulignant ainsi le potentiel de la microindentation pour détecter la fibrose causée par l'irradiation, et montrant que la raideur n'était pas détectée par la microindentation en l'absence de dépôt histologique fibrotique d'ECM.

a Le profil micromécanique (bleu) était comparable à ceux des tissus sains témoins du même âge (4 mois après irradiation) (gris). b L'analyse histologique a montré un dépôt plus dense d'ECM (*) chez un animal répondant aux rayons X (à gauche) accompagné d'une augmentation de la rigidité. L'histologie sur vessie sans enraidissement (à droite) a révélé l'absence de lésion fibrotique (4 mois après irradiation). Les données sources derrière les graphiques et les diagrammes peuvent être trouvées dans https://figshare.com/projects/Micro-mechanical_fingerprints_of_the_rat_bladder_change_in_actinic_cystitis_and_tumor_presence/158222.

Afin d'étudier l'effet du développement et de la progression de la tumeur sur la mécanique de la vessie, l'évolution de l'élasticité de la vessie a été étudiée sur un modèle de rat orthotopique, dans lequel les rats ont été abreuvés avec de l'eau contenant la nitrosamine cancérigène spécifique de la vessie (BBN) (Fig. 4a) . Ce modèle permet de surveiller toutes les étapes du développement et de la progression du cancer de la vessie, imitant ainsi les processus pathologiques qui se produisent chez l'homme.

a) Établissement de modèles animaux. Gradients représentatifs de rigidité de la paroi de la vessie recueillis avec nanoindenteur à (b) 2 mois de traitement BBN, où la dysplasie de l'urothélium est marquée par * ; (c) 4 mois de traitement BBN, où la tumeur pTa limitée à l'urothélium sans envahir la lamina propria est marquée par **. Les tumeurs pT1 dans lesquelles les cellules tumorales urothéliales rompent la membrane basale et envahissent la lamina propria en dessous à 4 et (d) 6 mois de traitement BBN sont marquées par ***. U : urothélium, L : lamina propria, M : muscle. YM de vessies traitées au BBN (noires) à (e) 2 mois, (f) 4 mois et (g) 6 mois de traitement au BBN ; et comparaison avec des animaux sains du même âge (gris) mesurés à la fois avec le nanoindenteur et l'AFM. N = 3 rats par point de temps et condition, chaque couche de tissu de chaque rat est caractérisée par plus de 3000 mesures de courbe de force. Les données présentées sont des logarithmes en base 10 de YM (en Pa). h Pli de variation de la moyenne des valeurs médianes de log10 YM des rats traités ± écart type (avec erreur propagée) par rapport aux rats témoins. Le test T a montré un ramollissement statistiquement significatif par rapport aux animaux témoins (la moyenne ± l'écart type avec l'erreur propagée est indiqué. ns=non significatif, *=valeur p < 0,05, **=valeur p < 0,005, ***=valeur p < 0,0005). i Moyenne des valeurs médianes de chaque rat. L'Anova à 2 voies a montré que des différences statistiquement significatives dans le modèle BBN ont été observées dans l'urothélium du mois 2 au mois 4 et du mois 4 au mois 6 ; et pour la lamina propria du mois 4 au mois 6. Les données sources derrière les graphiques et les tableaux peuvent être trouvées dans https://figshare.com/projects/Micro-mechanical_fingerprints_of_the_rat_bladder_change_in_actinic_cystitis_and_tumor_presence/158222.

Après 2 mois de traitement par BBN, les tissus de la vessie présentaient une dysplasie de bas grade, ce qui signifie qu'il existe des cellules épithéliales présentant une organisation anormale (Fig. 4b). La présence de cellules anormales était limitée à l'urothélium, qui augmentait son épaisseur et sa cellularité, sans envahir la lamina propria en dessous. De plus, le BBN active les voies de l'inflammation dans la vessie. À ce stade, les tissus vésicaux dysplasiques étaient caractérisés par une altération de l'élasticité de l'urothélium, corrélée à l'élargissement de la couche cellulaire et à la présence de cellules anormales (Fig. 4b, e). La lamina propria et les couches musculaires présentaient des profils YM équivalents à ceux des animaux témoins du même âge, et le tissu global ne différait pas significativement du tissu vésical sain.

Après 4 mois de traitement BBN, les tissus de la vessie présentaient des tumeurs non invasives localisées dans l'urothélium (pTa), et il y avait peu de points d'invasion focale dans lesquels quelques groupes de cellules envahissaient superficiellement la lamina propria ci-dessous (pT1) (Fig. 4c ). Ces tissus vésicaux ont montré un ramollissement dans l'urothélium par rapport aux témoins (Fig. 4f) de 0,81 fois (Fig. 4h), ainsi que dans la lamina propria qui présentait une très large distribution de rigidité (0,78 fois). On peut apprécier que la distribution de l'élasticité du muscle ait légèrement commencé à se déplacer vers des valeurs YM inférieures par rapport au muscle sain, avec un changement de pli de 0,87 par rapport au tissu musculaire témoin, même si les cellules cancéreuses n'ont pas encore envahi cette couche tissulaire. La distribution YM du tissu entier était caractérisée par un profil bimodal : un pic inférieur qui correspondait à la présence de cellules tumorales dans l'urothélium et dans la lamina propria, et un pic plus rigide qui correspondait à la couche de tissu musculaire sans la présence de cellules tumorales. , qui chevauchait partiellement le tissu sain (Fig. 4f).

Après 6 mois de traitement au BBN, des cellules tumorales étaient présentes dans la lamina propria (pT1) (Fig. 4d). De plus, à ce moment, les vessies traitées étaient caractérisées par des distributions d'élasticité décalées vers des valeurs plus douces pour l'urothélium et la lamina propria (Fig. 4g). Le tissu musculaire présentait une distribution bimodale avec un pic décalé vers des valeurs inférieures et un second pic qui chevauchait ceux de la vessie saine (Fig. 4g). Probablement en raison du vieillissement physiologique des animaux entraînant une augmentation de l'élasticité des tissus, le changement de pli par rapport aux témoins était moins spectaculaire, la lame étant 0, 93 plus douce et le muscle 0, 90 plus doux (Fig. 4h). Nous avons émis l'hypothèse que le principal contributeur à ce ramollissement de la vessie était la présence de cellules tumorales dans les tissus, qui sont largement connues pour être plus molles que leurs homologues en bonne santé. Néanmoins, un ramollissement des différentes couches a été détecté avant l'invasion des cellules tumorales (pour la lamina et le muscle au mois 4, et pour le muscle au mois 6). Dans l'ensemble, le microenvironnement néoplasique était plus doux que celui des animaux sains, même lorsque cet effet adoucissant était combiné au vieillissement physiologique de ces animaux.

Une fois que nous avons étudié la mécanique des tumeurs de la vessie sur un modèle murin qui permet un suivi plus étroit des tumeurs à un stade précoce, nous avons caractérisé le profil micromécanique d'un MIBC de haut grade chez un patient ayant subi une cystectomie radicale. Dans ce contexte, nous avons étudié des échantillons chirurgicaux appariés comprenant le tissu musculaire infiltré par des cellules néoplasiques et le tissu musculaire non envahi. Cette stratégie permet de caractériser les tissus néoplasiques vs non néoplasiques, mais en évitant la variabilité entre les donneurs. Le tissu musculaire normal était caractérisé par une YM qui suivait approximativement une distribution gaussienne après transformation logarithmique, avec une valeur médiane de 3,52 Log10(YM/Pa) (33 kPa en échelle linéaire), tandis que l'infiltration néoplasique des cellules tumorales sur le tissu musculaire entraînait une augmentation de l'hétérogénéité mécanique et un ramollissement global du tissu (valeur médiane de 3,28 Log10(YM/Pa), 2 kPa en échelle linéaire) (Fig. 5).

a Coloration à l'hématoxyline-éosine d'un cancer de la vessie invasif musculaire et d'un tissu musculaire non néoplasique apparié d'un patient atteint d'un carcinome urothélial de haut grade. b Profil mécanique du tissu musculaire néoplasique (orange) et non néoplasique (bleu) du même patient (n = 1). Données collectées avec le nanoindenteur. Les données sont présentées sous forme de logarithme en base 10 de YM (en Pa). Les données sources derrière les graphiques et les diagrammes peuvent être trouvées dans https://figshare.com/projects/Micro-mechanical_fingerprints_of_the_rat_bladder_change_in_actinic_cystitis_and_tumor_presence/158222.

Cette étude détaille la mécanique des trois couches tissulaires de la vessie à l'échelle microscopique, dévoilant ainsi l'hétérogénéité en termes d'élasticité des trois couches tissulaires, de raidissement tissulaire pour la cystite actinique et de ramollissement des trois couches lors de l'apparition et de la progression du cancer de la vessie. En fournissant une caractérisation mécanique à l'échelle microscopique, nous avons fourni ici de nouvelles informations concernant les changements dans l'environnement néoplasique selon le mode d'invasion du cancer de la vessie, c'est-à-dire par des cellules individuelles ou un petit groupe de cellules.

Au meilleur de notre connaissance, dans cette étude, nous avons réalisé la première cartographie micromécanique spatiale et temporelle de l'ensemble de la paroi vésicale, avec une résolution spatiale au niveau du micron, à la fois dans l'état de santé, la cystite actinique et le cancer de la vessie. La méthodologie utilisée ici était d'abord l'AFM, l'étalon-or en mécanobiologie pour étudier la mécanique cellulaire. Néanmoins, l'étude des propriétés mécaniques des tissus doit traiter de plus grandes régions d'échantillonnage, ce qui signifie une échelle de test accrue, une rugosité de surface et une hétérogénéité mécanique de l'échantillon. Cela nécessite d'abord une plage piézo Z accrue et une deuxième boucle d'indentation fermée pour mesurer toutes les hétérogénéités mécaniques (pour sonder des régions très douces et très rigides dans une grande zone d'échantillonnage). D'autre part, il a déjà été signalé que les recherches sur la mécanique basée sur la nanoindentation souffraient de problèmes de réplication, qui ont été surmontés à l'échelle cellulaire24, mais pas encore à l'échelle tissulaire. Ainsi, dans le but de surmonter les défis techniques liés au test d'échantillons aussi complexes et d'augmenter la robustesse et la reproductibilité de nos résultats, ainsi que leur traduction éventuelle dans les cliniques, nous avons ici combiné deux instruments basés sur l'indentation : l'AFM et un nanoindenteur, qui surmonte de tels techniques et a permis la validation de nos propres données.

Nous avons démontré que la paroi de la vessie est un tissu hétérogène hautement mécanique, caractérisé par un gradient de rigidité de l'urothélium à la lamina propria et à la couche musculaire. Nous avons également montré un effet du vieillissement sur la mécanique tissulaire, qui est connu pour altérer l'histologie de la vessie murine25. La compréhension de la mécanique tissulaire et de la distribution correspondant aux différentes couches tissulaires anatomiques - comme cela a déjà été rapporté pour des organes tels que la cornée26 ou la peau27 - est également pertinente pour la vessie, car sa fonction physiologique comprend une tension élastique élevée et un stress mécanique, et elle peut être crucial à des fins de reconstruction de la vessie.

La fibrose résulte de l'accumulation pathologique de protéines ECM due à une inflammation chronique, entraînant une cicatrisation et un épaississement des tissus et, finalement, une défaillance d'organe15. Nous avons utilisé l'irradiation aux rayons X pour établir un modèle animal de cystite actinique, afin de caractériser les empreintes mécaniques du tissu fibrotique de la vessie. En utilisant la représentation de l'histogramme du YM, nous avons identifié un raidissement de l'urothélium 2 mois après l'irradiation, ce qui suggère que l'effet principal de l'irradiation était sur les cellules, dont il est bien connu qu'elles induisent l'apoptose cellulaire28, et les cellules apoptotiques ont été précédemment rapportées comme étant plus rigide29. Au deuxième moment étudié, soit 4 mois, un enraidissement de la lamina propria et du muscle s'est produit, en accord avec une étude précédente30. Le YM chez l'animal irradié de 6 mois n'a pas changé par rapport à l'animal traité de 4 mois, tandis que la mécanique de la vessie chez l'animal témoin a augmenté de 4 à 6 mois, masquant l'effet du traitement.

L'étude de l'élasticité tissulaire par microindentation a également permis de détecter l'absence de fibrose vésicale sur un animal irradié n'ayant pas développé de cystite actinique. Cette information soutient le potentiel diagnostique de la quantification de l'élasticité tissulaire à l'échelle microscopique, qui pourrait être utilisée pour avoir des informations plus détaillées sur le stroma réactif caractéristique des processus fibrotiques, qui est généralement étudié par des techniques histologiques.

Nous avons également observé une augmentation de la compliance tissulaire en présence de tumeur de la vessie, à la fois dans le modèle du rat et chez l'homme, similaire à ce qui a été rapporté pour les tissus du cancer du foie31. En principe, cette observation peut sembler controversée et contraire à la tendance générale des tumeurs solides (c'est-à-dire les cancers du sein32 et du poumon33, dominés par l'envahissement cellulaire collectif34), où l'enraidissement a généralement lieu. Un raidissement tissulaire est également observé lors de l'étude d'organes urologiques comme la prostate ou le testicule par des techniques macroscopiques non invasives4. Néanmoins, en fournissant des cartes micromécaniques spatialement résolues, nous avons pu mesurer ici la contribution à l'élasticité tissulaire des cellules et de l'ECM. Dans la tumeur MIBC, nous avons trouvé une augmentation de l'hétérogénéité de l'élasticité du tissu lorsque le tissu est envahi par des cellules néoplasiques, comme précédemment rapporté pour le cancer du sein32. De plus, il a été précédemment établi que les cellules tumorales sont plus molles que leurs homologues bénignes et que le ramollissement des cellules cancéreuses augmente avec l'augmentation de la malignité35.

D'autre part, le raidissement de l'ECM est de plus en plus reconnu comme un signal mécanique majeur, qui modifie le comportement cellulaire et confère en partie des capacités caractéristiques des cellules cancéreuses, notamment une croissance soutenue, une invasion et des métastases36. Une telle augmentation de la rigidité de la MEC est principalement associée à une augmentation du dépôt de collagène37,38 en particulier au niveau du front invasif des tumeurs, qui correspond en outre souvent à la région la plus rigide du tissu tumoral39. Un exemple de stroma fibrotique tumoral est le cas du cancer du sein, dans lequel les tumeurs du sein sont caractérisées par un dépôt accru de collagène ainsi qu'une linéarisation et un épaississement accrus des fibres de collagène40,41. Les tumeurs caractérisées par un dépôt de stroma fibreux sont connues pour être plus rigides, comme le sein et le pancréas42. De plus, il a été rapporté pour les patients NMIBC une association avec COL1A1 et COL1A243. Par conséquent, il serait éventuellement intéressant d'étudier les tissus vésicaux décellularisés pour étudier la contribution de l'ECM à la rigidité de l'ensemble de l'organe et étudier les associations éventuelles avec l'augmentation de l'expression du collagène rapportée chez les patients atteints d'un cancer de la vessie non invasif musculaire avec un mauvais pronostic43.

De plus, dans les tumeurs de la vessie, les cellules cancéreuses migrent sous forme de cellules uniques ou de petits nids33, contrairement aux tumeurs dans lesquelles une raideur est signalée, par exemple les cancers du sein, de la prostate et du poumon33. L'invasion unicellulaire peut être divisée en migration mésenchymateuse et amiboïde33. Peu d'études ont montré que le cancer de la vessie envahissant les muscles favorise une meilleure contractilité des cellules grâce à la migration amiboïde, qui, contrairement à la migration mésenchymateuse, se produit lorsque la matrice environnante est relativement molle44. En étudiant les profils d'élasticité de la tumeur de la vessie dans le modèle de rat, nous avons détecté un ramollissement dans ces couches de tissu sous la tumeur lorsque la tumeur n'a pas encore envahi. Ces résultats indiquent que les couches tissulaires subissent un remodelage mécanique avant d'être envahies par les cellules tumorales, soulignant ainsi le potentiel clinique de la mesure de l'élasticité tissulaire par microindentation pour le pronostic précoce du cancer de la vessie. Cette observation va dans le sens d'une étude précédente, qui rapporte que le remodelage mécanique des tissus entourant les cellules néoplasiques précède l'invasion des sphéroïdes de carcinome épidermoïde de la tête et du cou45. D'autres tests sur des échantillons cliniques sont nécessaires pour valider les informations obtenues ici en étudiant la mécanique des tissus à l'aide d'un modèle préclinique.

Une limite de notre étude est que les échantillons de vessie ont été congelés avant les mesures mécaniques. Même si aucun traitement chimique n'a été effectué et que les échantillons ont été considérés comme frais/congelés, il ne peut être exclu que la procédure de congélation/décongélation puisse inclure des artefacts sur les spécimens, ce qui soulève la possibilité de biais de sélection. Dans le but de réduire cet effet, nous avons utilisé un cryoprotecteur (OCT) qui protège l'échantillon de la formation de cristaux de glace et utilisé un protocole de congélation rapide. De plus, nous avons ici réalisé une étude comparative entre différentes conditions, donc les échantillons ont toujours été soumis à un protocole identique. Des études antérieures ont montré peu d'impact sur les propriétés mécaniques lors de la congélation des tissus46. Cependant, travailler avec des tissus congelés présente plusieurs avantages et différentes études AFM ont utilisé des échantillons cliniques fraîchement congelés27,47,48,49,50. De plus, le tissu congelé permet de préparer des coupes semi-fines, ce qui permet une analyse histologique et une corrélation avec l'examen histologique.

Une autre limite de notre travail concerne la modélisation mécanique : lors de l'estimation des propriétés élastiques, nous avons négligé les effets visqueux. Nous avons supposé que les valeurs que nous rapportons peuvent être considérées comme caractéristiques d'une réponse matérielle à basse fréquence, où les effets visqueux jouent un rôle négligeable. Néanmoins, le module d'Young ne donne qu'un aperçu partiel de la réponse mécanique du matériau. Par exemple, un travail récent51 a mis en évidence comment différentes quantités de collagène affectent à la fois la rigidité des tissus et la viscosité des agrégats cellulaires. Les études futures devraient se concentrer sur la caractérisation des effets viscoélastiques spécifiques à la couche.

Cette étude met en évidence l'hétérogénéité mécanique intrinsèque des différentes couches de la vessie. En fournissant des cartes micromécaniques à haute résolution, qui tiennent compte des trois couches anatomiques de la vessie, nous rapportons une altération des propriétés mécaniques du tissu vésical dans les conditions pathologiques de la cystite actinique et de la tumeur. De telles empreintes digitales mécaniques pourraient éventuellement ouvrir la voie à de futurs outils de diagnostic et de pronostic cliniques, tout en fournissant d'éventuelles indications à des fins de reconstruction de la vessie.

Des rats femelles Fischer ont été manipulés selon le protocole éthique #1114. Afin d'induire un stress d'étirement physiologique de la vessie, une imagerie par ultrasons (US) a été réalisée avant de sacrifier les animaux afin de déduire le volume d'instillation qui correspond à une vessie physiologiquement étirée (Fig. 6 et Fig. 3 supplémentaires). L'imagerie US a été réalisée sur une station d'imagerie Vevo3100 LAZR-X équipée d'un transducteur MX250D (FUJIFILM VisualSonics, Amsterdam, Pays-Bas). Le signal US a été collecté en acquérant des coupes axiales de la vessie de rat en utilisant les paramètres suivants : fréquence : 21 MHz ; gain : 15 dB ; taille de pas : 200 µm. Des images échographiques 3D en mode B de la vessie de rat ont été acquises et analysées avec le logiciel VevoLab 3.2.5.

Protocole de préparation des échantillons et pipeline d'expériences. Tout d'abord, une imagerie par ultrasons (US) est réalisée afin de déterminer le volume d'instillation vésicale cryoprotecteur OCT physiologique. Les animaux sont ensuite sacrifiés, le cryoprotecteur est instillé dans la vessie à travers un cathéter et la vessie est ensuite explantée et congelée. Des cryosections sont préparées et des expériences de microindentation sont réalisées sur les lames de tissu à la fois par AFM et nanoindenteur. Ensuite, une analyse histologique a été effectuée pour confirmer l'emplacement des couches anatomiques de la vessie.

Des rats Fisher femelles de 150 à 175 grammes âgés de deux mois (Charles River, Allemagne) ont été hébergés dans l'animalerie de l'hôpital IRCCS San Raffaele dans des conditions standard (température : 22 °C ± 2 ; humidité : 50 ± 10 % ; lumière/obscurité cycle : 12 h de lumière et 12 h d'obscurité). Après une période d'acclimatation d'une semaine, les rats ont été irradiés aux rayons X. Les animaux ont été anesthésiés avec de l'isofluorane 2–4 % 0,3–0,8 L et la vessie a été remplie de 450 µl de solution saline stérile via un cathéter PE5052. La vessie a été irradiée avec une seule dose de 20 Gy. La dose de rayonnement a été administrée à l'aide d'un micro-irradiateur dédié aux petits animaux (X-RAD225Cx SmART, PXI North Branford, CT, États-Unis) avec guidage par tomodensitométrie à faisceau micro-conique (CBCT). Les rats anesthésiés ont été positionnés sur le ventre sur la scène animale et les images CBCT ont été acquises en utilisant les paramètres suivants : tension du tube = 40 kVp, courant = 5 mA, taille de voxel = 0,2 mm3. La vessie a été profilée sur le scanner et trois faisceaux de dose de taille égale ont été réglés à des angles de 130°, 180° et 230° respectivement, en utilisant un collimateur de 10 × 10 mm2. La distribution de dose a été calculée au moyen d'un algorithme de Monte Carlo53 et la dose moyenne à la vessie a été ajustée à la dose prescrite de 20 Gy. Les réglages d'irradiation étaient : tension du tube = 225 kVp, courant = 13 mA. Le temps de livraison variait approximativement entre 2 et 5 min/champ et l'ensemble de la procédure (imagerie CT et radiothérapie) a été réalisée en 20-25 min/animal. Les rats ont ensuite été sacrifiés 2, 4 et 6 mois après la radiothérapie (3 rats par condition) et les vessies ont été préparées pour les tests histologiques et mécaniques.

Des rats Fisher femelles âgés de deux mois (Charles River, Allemagne) ont été hébergés dans l'animalerie de l'hôpital IRCCS San Raffaele dans des conditions standard (température : 22 °C ± 2 ; humidité : 50 ± 10 % ; cycle lumière/obscurité : 12 h clair et 12 h d'obscurité). Après une période d'acclimatation d'une semaine, les rats ont été divisés en deux groupes : un groupe (tumeur) qui a été arrosé avec 0,05 % de N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine (BBN ; Sigma Aldrich) et le deuxième groupe (témoin) arrosé avec de l'eau normale. Les rats ont ensuite été sacrifiés 2, 4 et 6 mois après le début du traitement (3 rats par condition) et les vessies ont été préparées pour les tests histologiques et mécaniques.

Toutes les procédures et études impliquant des animaux ont été réalisées selon des protocoles approuvés par le comité de protection et d'utilisation des animaux de l'IRCCS Ospedale San Raffaele, et conformément aux directives standard nationales et internationales.

Des échantillons appariés de tissu non néoplasique et de carcinome urothélial de la vessie ont été obtenus d'un patient (homme, 62 ans, avec MIBC-pT2 G3) par l'unité de pathologie de l'IRCCS Ospedale San Raffaele (Milan, Italie). Un consentement écrit formel a été obtenu par le comité d'examen institutionnel local (Comité d'éthique IRCCS Ospedale San Raffaele ; version modifiée du protocole URBBAN approuvée en novembre 2020). La collecte de données et tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le comité d'éthique IRCCS Ospedale San Raffaele, conformément aux directives et réglementations pertinentes énoncées dans la déclaration d'Helsinki. Toutes les méthodes ont été réalisées conformément aux directives approuvées. Tous les patients ont signé un consentement éclairé écrit acceptant de fournir leurs propres informations anonymes pour cette étude et les études futures.

Pour les spécimens de rat, une échographie vésicale a été réalisée afin de caractériser le volume d'instillation qui provoque un étirement physiologique de la vessie. Les animaux ont ensuite été euthanasiés au CO2 et par cathétérisme vésical (canule 22 G, BD, Italie) le cryoprotecteur OCT (Bio-Optica, IT) a été instillé dans la vessie (volume préalablement défini par imagerie US, allant de 200 à 400 µl selon taille et capacité d'étirement de chaque vessie) (Fig. 6). L'urètre a été fermé et la vessie a été explantée. Afin de préserver l'intégrité des échantillons, les vessies ont été congelées dans un milieu d'enrobage tissulaire (OCT Compound for Cryostat Sectioning) à -80 °C (isopentane et neige carbonique)54. Des spécimens humains ont été congelés de la même manière.

Pour l'analyse mécanique, des coupes de tissu de 50 µm d'épaisseur ont été préparées à l'aide d'un cryostat microtome, et les coupes fraîchement congelées ont été décongelées à température ambiante sur des lames de verre superfrost polarisées afin de les immobiliser pour des mesures mécaniques. L'OCT a été retiré avec une solution de tampon phosphate (PBS) avant le test mécanique. Des coupes congelées appariées de 10 µm d'épaisseur ont été décongelées, fixées au formol et colorées à l'hématoxyline-éosine pour des analyses histologiques complètes.

Le module de Young (YM) d'échantillons de tissu vésical a été caractérisé à l'aide du nano-indenteur Chiaro (Optics11) et du Bioscope Catalyst AFM (Bruker). Alors que les deux instruments fournissent des résultats similaires en termes de valeurs YM mesurées, la principale différence entre les deux techniques réside dans l'appareil utilisé pour mesurer la force appliquée à l'échantillon (Fig. 7).

La principale différence entre les deux instruments d'indentation est la plage piézo z, la détection de la déviation en porte-à-faux et le paramètre fixe lors des mesures.

Les valeurs du module de Young des différentes couches du tissu vésical ont été déterminées en ajustant le modèle Hertz55,56 à des ensembles de courbes de force par rapport à l'indentation (simplement des courbes de force, FC) acquises par AFM sur des sections de tissu de 50 µm d'épaisseur, comme décrit ailleurs24,57, 58, qui est précis tant que l'indentation δ est petite devant le rayon R :

Dans l'éq. (1), ν est le coefficient de Poisson, généralement supposé égal à 0,5 pour les matériaux incompressibles, et E est le module d'Young.

Des sondes en verre borosilicaté monolithique personnalisées constituées de billes de verre sphériques (SPI Supplies), avec des rayons R compris entre 5 et 10 µm, ont été fixées à des porte-à-faux sans pointe (Nanosensor, TL-FM) avec une constante de ressort nominale k = 3–5 N/ M. Les sondes ont été fabriquées et calibrées, en termes de rayon de pointe, selon un protocole personnalisé établi59. Les variations du rayon de contact étaient dues à la disponibilité technique des sondes individuelles lors des mesures et aux variations internes des billes de verre (au sein d'un même lot) utilisées pour la fabrication des sondes colloïdales. La constante de ressort du porte-à-faux a été mesurée à l'aide de la méthode d'étalonnage du bruit thermique60,61 et corrigée de la contribution de la masse ajoutée de la sphère62,63. La sensibilité à la déviation a été calibrée in situ et de manière non invasive avant chaque expérience en utilisant la constante de ressort précédemment caractérisée comme référence, selon la procédure SNAP24.

Toutes les mesures mécaniques ont été effectuées avec des échantillons de tissus immergés dans une solution PBS. Des ensembles de FC (volumes de force ou FV) ont été collectés dans des régions d'intérêt sélectionnées identifiées en exploitant l'alignement précis des images optiques et AFM obtenues à l'aide du module logiciel Miro intégré au logiciel AFM. L'accès optique et la conception des tranches de tissu ont permis de déplacer la sonde directement sur les différentes couches de la vessie (urothélium, lamina propria, couche musculaire) et de localiser les régions d'intérêt à analyser pour les propriétés mécaniques locales.

Chaque FV consistait généralement en un réseau de 144 à 225 FC, séparés spatialement de 5 à 10 μm, chaque FC contenant 8192 points, avec une longueur de rampe L = 6 à 10 μm, une charge maximale Fmax = 200 à 1500 nN et une fréquence de rampe f = 1 Hz. La charge maximale a été ajustée afin d'obtenir une indentation maximale typique dans la plage d'environ 2 à 5 μm. La vitesse d'approche typique de la sonde pendant l'indentation était de 12 à 20 µm/s.

Chaque couche de tissu a été caractérisée par la collecte d'au moins 15 FV indépendants dans différentes régions d'intérêt macroscopiquement séparées sur trois tranches de tissu différentes pour chaque rat (c'est-à-dire pour chaque organe de la vessie différent). Des lames de tissu de la région médiane de la vessie ont été sélectionnées afin de normaliser l'épaisseur de la paroi de la vessie (la section transversale de la vessie plus près des extrémités de la vessie a une couche musculaire plus épaisse). De plus, afin d'éviter les biais dus à l'échantillonnage d'une zone particulière de la vessie, nous avons choisi au hasard au moins quatre emplacements dans chaque section de tissu étudiée pour échantillonner les trois couches de tissu, en prenant comme référence les quatre points cardinaux de la section de tissu. Au total, chaque couche a été caractérisée par plus de 2000 FC par organe unique. L'analyse des données a été effectuée comme décrit précédemment ailleurs64.

Après le test mécanique, des coupes de tissus ont été fixées sur du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % et une coloration à l'hématoxyline-éosine a été effectuée sur la même tranche afin de fournir une confirmation rétrospective de l'emplacement anatomique de chaque région d'intérêt mesurée au cours de l'expérience de nanoindentation ( figure 6).

Des cartes mécaniques sur des vessies murines ont été collectées à l'aide d'un nanoindenteur Chiaro (Optics11 BV) dans au moins trois zones bien séparées dans chaque tranche collectée. Côté dimensions, une taille de pixel de 10 µm a été choisie avec une dimension globale de la carte de 100 µm dans la direction tangentielle (à travers les différentes couches), et quelle que soit la longueur nécessaire pour couvrir toute l'épaisseur de la paroi vésicale, de l'urothélium au muscle ( typiquement quelques centaines de s de µm).

La caractérisation mécanique des échantillons de vessie humaine a été réalisée avec le même nanoindenteur Chiaro. Des cartes allant jusqu'à 1 mm sur 1 mm (taille de pixel de 10 µm) ont été collectées dans les trois couches de tissu différentes à partir de deux morceaux de tissu différents par vessie. Trois à cinq lames de tissu par morceau de tissu ont été mesurées. Le modèle de Hertz (Eq. 1) a été ajusté aux courbes de force.

Les tissus ont été sondés à l'aide de porte-à-faux avec une constante de ressort d'environ 0, 5 N / m et un rayon d'environ 9 µm. Toutes les mesures ont été effectuées en mode de contrôle d'indentation (c'est-à-dire en boucle fermée pour que le taux d'indentation soit constant tout au long de la phase de chargement), avec un taux d'indentation de 5 µm/s et une indentation cible de 5 µm ; comme pour le cas de l'AFM, ce choix a également été fait pour respecter à la fois l'approximation de l'indenteur parabolique de la théorie hertzienne et pour éviter l'effet de fond donné par l'épaisseur finie de l'échantillon65,66.

Pour établir la profondeur d'indentation optimale, les YM obtenus à différentes plages d'indentation ont été comparés et la rugosité de surface a été analysée au moyen d'une profilométrie optique (Veeco WYKO NT9100 et OCT, (Fig. 4 supplémentaire). Ces dernières techniques ont montré une rugosité dépendante de l'échelle. , avec des valeurs de rugosité arithmétique d'environ 2 à 300 nm lorsque des zones de ~ 10 µm de rayons ont été analysées (c'est-à-dire l'échelle du contact de la sphère du pénétrateur). première portion de contact. Nous avons considéré qu'un ajustement était valide lorsque R2 était > = 0,90. Nous avons également comparé les résultats d'ajustement pour différentes plages de profondeur d'indentation (1–3 µm, 3–5 µm) : nous avons observé qu'à différentes profondeurs d'indentation YM est resté essentiellement le même, avec une légère augmentation du nombre d'ajustements rejetés avec l'augmentation de la profondeur d'indentation (Fig. 5 supplémentaire), suggérant un léger comportement non linéaire à des déformations plus importantes. Nous avons choisi de limiter l'analyse aux indentations peu profondes ( 0,2 à 1,2 µm) pour maintenir des résultats plus cohérents et comparer plus facilement les résultats à l'ensemble de données AFM ; ce choix a également assuré que l'indentation maximale était significativement plus grande que la valeur de rugosité typique.

Des cryosections de vessie de 10 µm d'épaisseur ont été préparées, l'OCT a été lavé avec du PBS et les lames de tissus ont été fixées sur du PFA à 4 %. Ensuite, la coloration à l'hématoxyline éosine (HE) a été effectuée comme suit ; les lames ont été lavées deux fois sur de l'eau MilliQ et les noyaux cellulaires ont été colorés avec de l'hématoxyline pendant 50 secondes, puis lavés pendant 5 min dans de l'eau MilliQ et incubés sur de l'éosine pendant 15 secondes. Après lavage, les lames de tissu ont été déshydratées sur un gradient croissant d'éthanol puis incubées sur du xylène comme agent de clarification. Les échantillons ont ensuite été montés avec Eukit. Une analyse histopathologique complète à partir de lames HE a été réalisée par notre uro-pathologiste expérimenté (RL) en aveugle par rapport aux données mécaniques. De plus, les mêmes tranches de tissu précédemment utilisées pour les mesures mécaniques (50 µm d'épaisseur) ont été fixées et colorées HE afin de confirmer les couches de tissu (20 secondes d'hématoxyline et 15 secondes d'éosine).

La quantification du collagène à partir de tissus colorés HE a été réalisée en quantifiant la biréfringence du collagène à partir d'images acquises avec une lumière polarisée au microscope à fond noir (Zeiss AxioImager M2M). Toutes les images ont été capturées à l'aide d'un objectif 10X (APOCHROMAT 10X - NA 0. 4 5) et analysées avec le logiciel ImageJ. Les images ont d'abord été transformées en images 8 bits, le seuil a été ajusté manuellement afin de supprimer le bruit de fond et de collecter tous les pixels positifs du tissu. Le pourcentage de la fraction de surface au-dessus du seuil établi a été quantifié.

La valeur médiane de YM par couche de tissu et rat a été calculée. Étant donné que les instruments AFM et nanoindenteur fournissent des valeurs YM comparables et que les courbes de force sont conceptuellement mesurées de la même manière, les résultats rapportés ici représentent des données en double collectées à la fois par AFM et nanoindenteur, et des valeurs médianes tirées telles qu'obtenues par les deux instruments par rat et couche de tissu .

Afin d'analyser l'effet de l'irradiation aux rayons X et du traitement BBN dans chaque couche de tissu, nous avons calculé les modifications médianes du pli YM par rapport aux rats sains. Pour ce faire, nous avons d'abord fait la moyenne de l'AFM et de la valeur médiane YM de chaque rat pour chaque couche de tissu à un moment précis. Cela donne 3 valeurs médianes (une par rat), à chacune des conditions étudiées. Comme nous étions intéressés par les changements (mécaniques) consécutifs à une maladie, nous avons apparié des animaux traités/témoins. Comme chaque rat mesuré était un point final, nous avons supposé que tout état pathologique pouvait provenir de n'importe lequel des rats sains. Cela signifie que les changements de pli possibles par conditions sont les combinaisons de 3 rats témoins et 3 rats traités par point de temps ;

(C = témoin, T = traité)

Rat1T/Rat1C, Rat2T/Rat1C, Rat3T/Rat1C,

Rat1T/Rat2C, Rat2T/Rat2C, Rat3T/Rat2C,

Rat1T/Rat3C, Rat3T/Rat3C, Rat3T/Rat3C.

Cela donne 9 nombres par traitement et point de temps. Si nous soustrayons 1 (pas de changement de pli des rats témoins) de chacun, nous pouvons alors tester la distribution résultante avec un test t à 2 voies pour vérifier l'hypothèse qu'elle a une moyenne non nulle.

Pour étudier la cinétique du traitement, une Anova bidirectionnelle avec le test de comparaison multiple de Tukey a été réalisée, en comparant la moyenne des valeurs médianes de YM de chaque couche de tissu de chaque rat unique à différents moments. Nous avons vérifié la normalité des distributions YM en effectuant des tracés quantile-quantile (QQ) par rat et couche de tissu pour les deux instruments. Pour les distributions YM qui n'étaient pas distribuées normalement, un test statistique non paramétrique a été effectué (test de Mann-Whitney).

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Toutes les données sources derrière les graphiques et les diagrammes peuvent être trouvées dans https://figshare.com/projects/Micro-mechanical_fingerprints_of_the_rat_bladder_change_in_actinic_cystitis_and_tumor_presence/158222. Les données sources sont incluses dans les données supplémentaires 1–9. Toute information restante peut être obtenue auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

Code disponible auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Nous remercions H. Holuigue et E. Lorenc pour leur soutien dans les mesures AFM. Cette recherche a été financée par le programme de recherche et d'innovation Horizon 2020 de l'Union européenne, dans le cadre de la convention de subvention de l'action Marie Skłodowska-Curie n° 812772 (projet Phys2Biomed) et a reçu un financement du programme de recherche et d'innovation Horizon 2020 de l'Union européenne dans le cadre de la convention de subvention 801126 (EDIT ).

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R. Luciano

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Correspondance à A. Podestà ou M. Alfano.

MB et KB sont employés chez Optics11 BV Tous les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Martinez-Vidal, L., Chighizola, M., Berardi, M. et al. Les empreintes digitales micromécaniques de la vessie de rat modifient la cystite actinique et la présence de tumeurs. Commun Biol 6, 217 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04572-0

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Reçu : 19 août 2022

Accepté : 09 février 2023

Publié: 24 février 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04572-0

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