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Communications Biology volume 6, Article number: 572 (2023) Citer cet article

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La souris de laboratoire a fourni des informations considérables sur les fondements de la physiologie du système nerveux central des mammifères. Ces dernières années, il est devenu possible d'imager des neurones uniques, des cellules gliales et des cellules vasculaires in vivo en utilisant des préparations fixées sur la tête combinées à des fenêtres crâniennes pour étudier les réseaux locaux d'activité dans le cerveau vivant. De telles approches ont également réussi sans l'utilisation d'une anesthésie générale fournissant des informations sur les comportements naturels du système nerveux central. Cependant, la même chose n'a pas encore été développée pour l'œil, qui est constamment en mouvement. Ici, nous caractérisons une nouvelle préparation à tête fixe qui permet l'imagerie rétinienne par optique adaptative à haute résolution au niveau d'une seule cellule chez des souris éveillées. Nous révélons trois nouveaux attributs fonctionnels de l'œil normal qui sont négligés par l'anesthésie : 1) Mouvement oculaire à haute fréquence et faible amplitude de la souris qui n'est présent qu'à l'état éveillé 2) Le flux sanguin unicellulaire dans la rétine de la souris est réduite sous anesthésie et 3) les rétines de souris s'épaississent en réponse à l'anesthésie à la kétamine/xylazine. Ici, nous montrons les principaux avantages de la préparation éveillée qui permet l'étude de la physiologie rétinienne sans anesthésie pour étudier la physiologie rétinienne normale chez la souris.

La souris de laboratoire est un modèle indispensable pour la recherche biomédicale en raison de sa taille, de son accessibilité, de son catalogue génétique séquencé et de sa capacité à modéliser les aspects de la maladie humaine. Elle a notamment permis l'étude de l'anatomie et de la fonction de l'œil des mammifères qui, outre sa taille et l'absence notable de fovéa, ressemble à bien des égards à l'œil humain1. Pour obtenir une imagerie rétinienne à haute résolution chez la souris, une anesthésie est généralement nécessaire pour stabiliser la préparation et supprimer les mouvements oculaires qui rendent les évaluations fonctionnelles au niveau cellulaire presque impossibles2. Certaines approches ont démontré que l'imagerie rétinienne de la souris est possible avec la retenue des mains3,4, cependant, l'utilité de cette approche est à des fins photographiques à un seul instantané et ne fournit pas un axe optique stable qui est essentiel pour les mesures fonctionnelles.

L'anesthésie générale fournit une préparation in vivo stabilisée et atténue le mouvement des yeux ; cependant, il peut également altérer la fonction physiologique normale, limitant ainsi l'interprétation des mesures in vivo, en particulier celles de la fonction du système nerveux central (SNC)5,6. À cette fin, les neuroscientifiques comportementaux et physiologiques ont développé des préparations fixées sur la tête pour stabiliser le cerveau pour l'électrophysiologie et la microscopie in vivo7, évitant ainsi le besoin d'anesthésie. Notamment, des études ont rapporté diverses différences neurophysiologiques clés entre l'état éveillé et l'état anesthésié8,9. Une autre conséquence de l'anesthésie pour la recherche visuelle est qu'elle supprime le mouvement oculaire naturel qui offre un contraste spatio-temporel au système visuel. La suppression du mouvement naturel des yeux modifie fondamentalement la cinétique spatio-temporelle de la sortie des cellules ganglionnaires vers le noyau géniculé latéral, le colliculus supérieur et les études du cortex visuel chez la souris10. Il existe également des rapports selon lesquels la locomotion dans la préparation éveillée modifie considérablement la réponse physiologique du cortex visuel11, mais les mécanismes ne sont pas entièrement compris. Par conséquent, laisser le mouvement oculaire intact pourrait faire progresser la compréhension du comportement oculomoteur de la souris et, en particulier, comment le mouvement oculaire biologique peut avoir un impact sur la physiologie visuelle de base.

En plus des avantages de préserver le mouvement des yeux et d'éliminer les confusions de l'anesthésie, l'imagerie de la souris éveillée peut également aider l'imagerie rétinienne dans plusieurs aspects supplémentaires. Premièrement, l'imagerie de l'animal éveillé peut empêcher l'opacification optique d'une anesthésie prolongée, ce qui a été un énorme défi pour l'imagerie oculaire chez la souris anesthésiée12. Deuxièmement, la thermorégulation n'est pas nécessaire lors de l'imagerie de la souris éveillée, ce qui a montré un impact sur la physiologie homéostatique13. Et enfin, la souris éveillée maintient une clarté oculaire normale en clignant des yeux et en rafraîchissant constamment le film lacrymal sans avoir besoin de lentilles de contact ou de lubrification, ce qui pourrait confondre les conditions optiques comportementales ou naturelles14.

Ici, nous reconnaissons de nombreux avantages potentiels de l'étude de la rétine de souris éveillée à haute résolution sans anesthésie et surmontons un certain nombre des limitations ci-dessus en développant et en caractérisant une préparation à tête retenue pour l'imagerie rétinienne. Nous fournissons un appareil open-source entièrement imprimé en 3D pour maintenir la tête de la souris afin de fournir un élève stable avec un corps suspendu au-dessus d'un cylindre rotatif qui permet une ambulation libre et une mesure simultanée de la vitesse et du comportement ambulatoires. Nous mesurons la stabilité de l'axe optique qui facilite l'imagerie rétinienne structurelle et fonctionnelle à haute résolution. Nous montrons en outre l'utilité en imageant l'œil de la souris avec une ophtalmoscopie laser à balayage multimodal commerciale (SLO) et une tomographie par cohérence optique (OCT). Nous démontrons ensuite les avantages de l'imagerie haute résolution à l'aide d'un ophtalmoscope à balayage optique adaptatif personnalisé (AOSLO) pour visualiser diverses structures cellulaires rétiniennes à une résolution de l'ordre du micron. La stabilité de l'œil et la qualité de l'image chez la souris éveillée sont validées pour l'imagerie SLO et AOSLO. En utilisant l'imagerie AOSLO à balayage de ligne à grande vitesse AOSLO15,16, nous découvrons un mouvement oculaire de type micro-tremblement jusqu'alors négligé. Dans ces premiers travaux, nous présentons plusieurs opportunités scientifiques en mettant en évidence trois changements physiologiques clés de la rétine induits par l'anesthésie.

L'approche générale et la configuration sont présentées à la Fig. 1a. Le crâne de la souris a été maintenu stable grâce à une plaque frontale fixée. La plaque de tête en forme de Y a été implantée au centre du crâne de la souris parallèlement à l'axe antéro-postérieur après une seule incision chirurgicale à travers le cuir chevelu sous anesthésie (Fig. 1b). Toutes les souris ont survécu à la procédure. Les souris plaquées sur la tête présentaient un comportement normal et maintenaient une apparence extérieure saine avec un pelage soigné et un niveau d'activité normal. Aucune inflammation ou autre effet secondaire lié à l'implantation de la plaque frontale n'a été observé. Les poids de toutes les souris sont également restés constants avant et après la chirurgie. Dans les 3 jours suivant le placement chirurgical de la plaque frontale, les souris à tête retenue se sont acclimatées à l'appareil au cours de cinq séances d'entraînement d'une durée de 30 à 60 min. La plaque frontale en forme de Y était montée sur un bras fixe suspendu au-dessus d'un cylindre rotatif de sorte que les souris pouvaient se déplacer librement d'avant en arrière. Après l'entraînement et l'acclimatation dans l'appareil à tête fixe, les souris n'ont pas montré d'aversion ou de réponse de retrait et ont maintenu un comportement de toilettage normal (vidéo supplémentaire 1), indiquant en outre un état de base calme sans signes extérieurs de détresse17,18. La chirurgie de la plaque frontale a laissé l'œil ouvert avec un réflexe de clignement normal (Vidéo supplémentaire 1).

une préparation à tête retenue pour l'imagerie rétinienne de souris éveillées et se comportant. Une plaque frontale en forme de Y implantée chirurgicalement sur le crâne de la souris retient le mouvement de la tête, tandis que la déambulation est autorisée sur un cylindre de rotation pendant l'imagerie. b Schéma montrant la position de la plaque frontale au centre du crâne de la souris parallèlement à l'axe antéro-postérieur. c Une photographie de la souris à tête retenue imagée avec SLO commercial. d Image cSLO multimodale de la rétine chez les souris éveillées à tête retenue. Différentes structures rétiniennes sont visualisées (gauche - droite) : la réflectance et l'imagerie autofluorescente révèlent les principaux vaisseaux sanguins rétiniens superficiels et les faisceaux de fibres nerveuses sous les deux canaux NIR (haut) et bleu (bas). Co-enregistrement fluorescent de l'angiographie au vert d'indocyanine excitée NIR (ICGA) des réseaux de vaisseaux sanguins superficiels (rendu en pseudo-couleur rouge) avec des cellules immunitaires marquées par fluorescence excitées en bleu (rendu en pseudo-couleur verte) chez une souris transgénique CX3CR1. ICGA du réseau de vaisseaux sanguins choroïdiens profonds. e cube OCT et une section représentative b-scannée imagée dans une souris éveillée à tête retenue. f Les images AOSLO montrent des capacités multimodales. À gauche : l'image de réflectance confocale révèle le faisceau de fibres nerveuses et les capillaires rétiniens. Milieu : imagerie en contraste de phase d'un microkyste et d'une branche de vaisseaux sanguins rétiniens. Droite : image de fluorescence d'une cellule ganglionnaire rétinienne marquée par YFP avec des dendrites et des axones mis en évidence.

L'appareil à tête retenue a permis une imagerie rétinienne structurelle et fonctionnelle de haute qualité à l'aide de plates-formes d'imagerie commerciales SLO et OCT sans l'aide d'optique adaptative (Fig. 1d, e et vidéo supplémentaire 3). Toutes les principales modalités d'imagerie par fluorescence, autofluorescence et réflectance étaient possibles en utilisant le système commercial SLO + OCT (Heidelberg Spectralis, Heidelberg Engineering, Allemagne). En utilisant la réflectance, les principaux vaisseaux sanguins rétiniens superficiels et les faisceaux de fibres nerveuses ont été révélés sous les canaux NIR et bleu. Des agents de contraste d'angiographie populaires pourraient également être utilisés chez la souris éveillée pour révéler une angiographie à la fluorescéine sodique (FA) avec une artériole, une veinule et une imagerie capillaire claires de la circulation rétinienne en utilisant une excitation de 488 nm ainsi qu'une fluorescence passe-long d'environ 500 nm. L'angiographie au vert d'indocyanine (ICGA) utilisant la lumière NIR a révélé à la fois la circulation rétinienne superficielle et a démontré une bonne pénétrance pour visualiser la circulation choroïdienne. La visualisation de la choroïde est particulièrement difficile chez la souris C57BL6/J car le RPE est densément pigmenté. Pour montrer le potentiel d'imagerie de la fluorescence transgéniquement marquée, nous avons également imagé la microglie fluorescente à l'aide de souris CX3CR1 avec une protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) dans des cellules contenant le récepteur 1 de la chimiokine CX3. Dans toutes les modalités d'imagerie SLO (fluorescence et réflectance), le seul -le contraste de l'image et le rapport signal sur bruit (SNR) étaient suffisants pour effectuer l'enregistrement à une fréquence d'images allant jusqu'à 8,8 Hz avec le logiciel d'enregistrement automatique intégré (supplémentaire vidéo 2). L'enregistrement en face a permis un enregistrement B-scan en temps réel pour les cubes OCT volumétriques et un SNR amélioré en faisant la moyenne de plusieurs images (ART, suivi automatique en temps réel)19. Nous avons imagé un cube OCT 3D avec 96 B-scans. En utilisant l'enregistrement en temps réel intégré et l'ART, le cube OCT a révélé une délimitation claire des couches rétiniennes comparable à celle obtenue avec l'anesthésie malgré les changements de regard résiduels et le mouvement des yeux lors de l'acquisition du cube complet.

Un défi majeur pour l'imagerie à haute résolution de la rétine de souris éveillée est que le faisceau d'imagerie entrant dans la pupille de l'œil de la souris (~ 2 mm) est sensible au mouvement de la tête et des yeux. Les défauts d'alignement des pupilles peuvent provoquer un écrêtage et un vignettage qui ont un impact sérieux sur la détection du front d'onde, brouillent l'image et créent une distribution/collecte de lumière instable pour les mesures fonctionnelles. Pour la plupart des applications à haute résolution, une pupille entièrement dilatée est souhaitable car elle maximise l'ouverture numérique (NA ~ 0,49), améliorant ainsi la résolution d'imagerie et l'efficacité de la collecte de la lumière. Cependant, cela crée également une exigence de stabilité pour aligner la pupille optique de l'instrument sur la pupille de l'animal. Pour quantifier la stabilité de l'axe optique pour l'imagerie rétinienne, la pupille de sortie de l'œil chez cinq souris éveillées a été imagée avec SLO pendant plus de 20 min. La pupille a été suivie et segmentée à partir des images SLO à l'aide d'un logiciel personnalisé (Fig. 2a et vidéo supplémentaire 3). La pupille de la souris a été suivie pour quantifier l'écrêtage spatial du faisceau sur la base d'un faisceau d'imagerie simulé de 2, 0 et 1, 6 mm de diamètre (Fig. 2b, c). Avec le faisceau de 2,0 mm, quatre souris ont montré une excellente stabilité de la pupille avec <1 % de surface moyenne de la pupille coupée au fil du temps. Un animal a montré plus d'écrêtage du faisceau (6,65%). Nous avons trouvé qu'il s'agissait d'une valeur aberrante en raison d'une chirurgie sous-optimale de la plaque frontale qui a laissé une ouverture incomplète des yeux en raison d'un affaissement mineur des paupières. En utilisant le plus petit faisceau d'imagerie de 1,6 mm, toutes les souris ont montré un écrêtage de faisceau négligeable, représentant 0,112 ± 0,18 % de la surface de la pupille (Moyenne ± SD, n = 5 souris). Pour évaluer l'impact temporel de l'écrêtage du faisceau (la fraction de temps pendant laquelle le faisceau a été écrêté de> 10%), nous avons évalué les vidéos SLO capturées à 8,8 images par seconde (fps). Nous avons constaté que 94, 75 ± 11, 13% des cadres étaient non écrêtés pour le faisceau de 2, 0 mm (moyenne ± SD, N = 5 souris) et 99, 78 ± 0, 30% des cadres étaient non écrêtés lors de l'utilisation d'un faisceau de 1, 6 mm. La petite fraction d'écrêtage de la pupille dans l'analyse spatiale ou temporelle a été attribuée principalement au comportement du regard de la souris plutôt qu'au manque de stabilité de la préparation de la plaque frontale. La stabilité de la pupille a également été examinée en comparant la position de la pupille par rapport à la vitesse de marche enregistrée simultanément. Il n'y avait aucune corrélation entre l'écrêtage du faisceau ou le centrage de la pupille avec le comportement de locomotion. Cela suggère que la stabilité de la pupille a été attribuée à une plaque frontale fixée de manière stable (Fig. 2d). L'analyse spatiale et temporelle suggèrent que la pupille est stable, même sous locomotion jusqu'à 0,8 m/s (environ ¼ de la vitesse maximale d'une souris non retenue). Ainsi, la préparation de l'œil de la souris éveillée se prête favorable à l'imagerie rétinienne continue qui facilite l'optophysiologie fonctionnelle dans des conditions plus naturelles.

a Image d'une pupille de souris capturée avec un SLO commercial. Le cercle solide jaune indique la limite de la pupille suivie de l'œil. Les cercles pleins et pointillés cyan indiquent respectivement la balise d'imagerie simulée de 2 et 1,6 mm de diamètre d'un système d'imagerie à haute résolution. b La cartographie de la persistance de la pupille révèle une pupille stable sur 20 min lors de l'utilisation de pupilles du système de 2 mm (plein) et de 1,6 mm (en pointillés) de diamètre. c L'axe y de gauche montre l'écrêtage de la pupille dans la zone et l'axe y de droite montre la fraction d'images non écrêtées (<10 % de la zone) au cours de la session d'imagerie de 20 minutes (N = 8 956 images). d Aucune corrélation évidente n'a été observée lors de la corrélation du mouvement des yeux de la souris et des vitesses de marche, ce qui montre une stabilité optique constante, quel que soit l'état de marche de la souris.

En plus du mouvement de la pupille, le mouvement oculaire, y compris les changements de regard et les clignements, peut perturber les approches d'imagerie stables. Nous avons donc quantifié le décalage du regard et le clignotement en imageant la rétine avec SLO pendant 20 min chez cinq souris éveillées. Comparé aux humains, le comportement de clignotement était beaucoup moins fréquent chez les souris (1,78 ± 0,8 clignements/minute, n = 5 souris) par rapport à celui des humains (~20 clignements/min)20. La durée mesurée du clignement des yeux de la souris était <340,9 ms, ce qui correspond à environ trois images dans le système SLO. Les rares événements de clignotement chez la souris facilitent l'imagerie ininterrompue au-delà de ce qui est possible dans l'imagerie rétinienne humaine. Les changements de regard ont été quantifiés en suivant les caractéristiques rétiniennes sur un FOV de 55° (8,8 fps). Les souris voyaient librement la scène visuelle de la configuration expérimentale avec des mouvements oculaires peu fréquents mais dirigés. Ceci a été mesuré sans orientation de la tête car l'appareil à tête fixe limitait le regard au seul mouvement des yeux. La majorité des décalages du regard rétinien se situaient sur l'axe horizontal couvrant une plage crête à crête observée de ± 18,00˚ FOV dans des conditions de vision libre. C'était important par rapport à ± 3,44 ° de mouvement suivi dans la dimension verticale (Fig. 3a et vidéo supplémentaire 3). Comme dans les études précédentes21, nous avons constaté que les changements de regard prédominants étaient > 5˚, rapides (~ 50˚/s) et rares (~ 7 par minute chez la souris, par rapport à plusieurs saccades par seconde chez l'homme). Comme les souris n'ont pas de fovéa, ces changements de regard ne sont pas de véritables saccades qui recentrent l'image sur la fovéa22, mais peuvent plutôt représenter une redistribution de la scène visuelle sur des zones plus denses en photorécepteurs ou des champs récepteurs de cellules ganglionnaires plus petits qui résident près de l'axe optique de l'oeil23. Vingt minutes de suivi vidéo semi-continu de la rétine de la souris, le comportement du regard a montré un schéma de persistance groupé sur plusieurs directions de regard préférées suggérant une position de repos naturelle de l'œil ou une direction de regard préférée basée sur les caractéristiques visuelles dans la salle de laboratoire. Pour déterminer la persistance des positions du regard, les données ont ensuite été divisées et normalisées à la position moyenne locale toutes les 10 s. À l'aide de cette analyse, nous avons constaté que la position rétinienne restait à moins de 5˚ de l'angle visuel 80,02 ± 0,065 % du temps dans les fenêtres de 10 s, ce qui correspond à la fenêtre d'acquisition vidéo typique de l'imagerie AOSLO haute résolution. Ceci est pertinent pour l'imagerie haute résolution car le champ sous-tendu pour l'imagerie AOSLO est généralement de 5˚, ce qui suggère que l'enregistrement d'image hors ligne peut corriger le mouvement par des approches d'enregistrement de bande ou d'image sans erreurs de "frame-out" qui rendent l'enregistrement d'image basé sur des caractéristiques communes ou approches de corrélation croisée difficiles24.

a La position du regard de la souris est mesurée en suivant les décalages rétiniens. Droite : position du regard suivi d'une souris à tête retenue pendant 20 min superposée sur un cadre représentatif de la rétine. À gauche : la trace de mouvement de 20 minutes montre les déplacements du regard dans les directions horizontale (en haut) et verticale (au milieu). Vitesse de marche enregistrée simultanément avec un encodeur rotatif sur la roue (en bas). b Positions du regard des cinq souris normalisées pour chaque fenêtre glissante de 10 s sur 20 min. Les histogrammes de la distribution de la position du regard superposés sur les axes horizontal et vertical montrent une forte probabilité de décalages rétiniens <5 ° (marqués comme une boîte en pointillés) dans la fenêtre d'imagerie de 10 secondes. c Corrélations de la vitesse du regard de la souris et de la vitesse de marche, le panneau inférieur montre le zoom avant de l'ensemble de données terminé étiqueté comme une boîte grise en haut pour la visualisation.

Les données de locomotion ont également été enregistrées simultanément à l'aide de l'encodeur rotatif pour étudier la corrélation potentielle entre la locomotion et le comportement du regard. La vitesse de marche et le mouvement des yeux ont de faibles corrélations négatives, à l'exception de la souris n° 4, qui avait une faible corrélation positive. (R = 0,0226 ; 0,0030 ; 0,1294 ; 0,0060 ; 0,0135, respectivement). Nous n'avons observé aucun changement évident du comportement du regard lorsque les animaux étaient au repos ou en mouvement (Fig. 3c). Cela suggère non seulement des enregistrements d'images stables indépendants de la locomotion des souris, mais également un manque de mouvement oculaire amélioré ou supprimé en correspondance avec la démarche.

La rareté des clignements combinée à la stabilité de l'axe optique et de l'ouverture de la pupille dans l'œil de la souris éveillée a rendu possible la détection et la correction du front d'onde à l'aide d'optiques adaptatives en boucle fermée. En utilisant la pupille d'entrée de 2, 0 mm de l'œil dilaté de la souris, nous avons constaté que les points de détection du front d'onde Hartman – Shack (HS) restaient brillants et avec une dispersion minimale permettant une correction pendant plus de 75 minutes (Fig. 4a – d). Cette préparation était comparable à la préparation anesthésiée optimale14,25. La position stable du point HS et de la pupille a permis une correction active de l'optique adaptative avec un écrêtage négligeable de la pupille. Les tensions de correction de front d'onde appliquées au miroir déformable se situaient dans la plage dynamique du miroir déformable, indiquant une course suffisante. Avec la correction AO en boucle fermée, le contraste de l'image rétinienne et le rapport signal sur bruit (SNR) sont restés relativement stables sur des enregistrements d'une durée supérieure à 1 h sans dégradation notable de la qualité de l'image au fil du temps (Fig. 4e).

a, b Imagerie corrigée par AO chez les souris anesthésiées (a) et éveillées (b) pendant 75 min. En haut : Spotgramme du front d'onde de la pupille capturé avec HSWS. Milieu : profil d'intensité moyenne du spot de la région identifiée par le rectangle orange). En bas : image AOSLO. L'intensité des modèles de points moyens a été respectivement normalisée à l'intensité maximale aux points temporels 0 dans les données d'éveil et d'anesthésie. c, d Comparaison des profils d'intensité des spots moyennés (marqués en pointillés dans a, b) à 0 min et 75 min. Tous les profils d'intensité ont été respectivement normalisés à leurs valeurs maximales. Chez la souris anesthésiée, la tache était légèrement élargie en 75 min, tandis que la souris éveillée était relativement stable. e Tracé de l'intensité maximale moyenne au fil du temps. La souris éveillée a montré une intensité de pic moyenne relativement stable ainsi que les souris anesthésiées avec une préparation optimale.

Après correction de l'AO, l'imagerie AOSLO haute résolution a révélé des structures rétiniennes cellulaires chez la souris éveillée, reflétant ce qui était possible dans les études précédentes mais sans anesthésie (Fig. 1f). En utilisant l'imagerie confocale NIR à 796 nm, des structures telles que des faisceaux de fibres nerveuses uniques et des capillaires de moins de 5 µm14 étaient visibles. À l'aide de l'imagerie à contraste de phase NIR, des structures translucides telles que des cellules sanguines simples16 et des parois de vaisseaux16 ont été visualisées. Cela a permis une mesure du débit sanguin sans étiquette (décrite ci-dessous). Pour montrer les capacités de fluorescence, nous avons imagé les cellules ganglionnaires marquées Thy-1 YFP et leurs tonnelles dendritiques sous une excitation de 488 nm. Les images AOSLO des trois modalités d'imagerie montrent un contraste et une résolution comparables à ceux précédemment capturés sous des souris anesthésiées. Toutes les modalités d'imagerie à contraste de phase, à réflectance confocale et à fluorescence NIR ont été réalisées en utilisant des niveaux de puissance lumineuse sûrs sans observation de détresse comportementale à la lumière d'imagerie (200 à 500 µW au niveau de la cornée pour le NIR, 220 à 330 µW au niveau de la cornée pour fluorescence). Bien que les longueurs d'onde NIR ne soient pas censées être visibles pour les souris, même l'utilisation de longueurs d'onde visibles brillantes n'a pas induit de comportement de grimace ou de clignotement excessif chez la souris, ce qui suggère que ces niveaux de lumière n'induisent pas de stress manifeste ou de photophobie. Le mouvement oculaire total dans les directions de regard préférées était généralement maintenu à moins de 5° du mouvement rétinien, ce qui signifie que les erreurs de « frame-out » dans l'enregistrement de l'image étaient peu fréquentes. Les corrections restantes à haute fréquence et à faible amplitude ont été observées et corrigées (Vidéo supplémentaire 5).

À l'aide de l'imagerie AOSLO, nous avons découvert que le mouvement rétinien était caractérisé par des déplacements du regard, des dérives lentes et un mouvement oculaire à haute fréquence et à faible amplitude jamais signalé auparavant chez la souris éveillée. L'inspection visuelle des données de débit vidéo révèle que les images individuelles présentent une oscillation/un cisaillement rapide dans des images uniques (~ 40 ms, décrit plus loin) et des mouvements du regard plus grands qui traduisent le champ. Sans correction, un tel mouvement des yeux conférera une distorsion/flou de mouvement, même si l'imagerie avec des optiques à diffraction limitée (Vidéo supplémentaire 5). Un enregistrement basé sur une bande parallèle à l'axe de balayage rapide (15 kHz) 26 a été déployé pour mesurer et corriger le mouvement ligne par ligne observé dans l'imagerie AOSLO de la souris éveillée (Fig. 5a et vidéo supplémentaire 6). Pour montrer l'avantage de l'approche d'enregistrement basée sur les bandes/lignes, nous montrons une correction numérique post-traitement du mouvement rapide de l'œil avec un contraste et une netteté considérablement améliorés des caractéristiques fines par rapport aux données brutes et à l'approche d'enregistrement du cadre du corps rigide ( figure 5b). Toutes les images de fluorescence présentées ici ont un contraste suffisant pour effectuer l'enregistrement de la bande dans chaque modalité d'imagerie à haute résolution sans nécessiter une stratégie de double enregistrement24. Nous avons également tracé un profil transversal des caractéristiques cibles spécifiques dans chaque modalité montrant une amélioration du contraste et de la netteté (Fig. 5c). L'enregistrement des bandes a révélé des détails fins des dendrites des cellules ganglionnaires rétiniennes marquées par YFP, un contraste vasculaire, ainsi qu'un contraste plus élevé des faisceaux de fibres nerveuses sur la surface rétinienne (Fig. 5c). De plus, la correction de mouvement basée sur la bande a amélioré le contraste et la netteté du contraste de mouvement qui révèle plus précisément la perfusion du flux sanguin qui est très sensible à l'artefact de mouvement27.

a Démonstration de l'enregistrement de la bande à l'aide d'une cellule ganglionnaire rétinienne marquée par YFP imagée à partir d'une souris éveillée à tête retenue. De gauche à droite : cadre de référence sélectionné manuellement avec le moins de distorsion, image AOSLO brute déformée par les mouvements oculaires, image enregistrée et trace de mouvement oculaire dans les directions horizontale et verticale. b Images moyennes de quatre modalités sans enregistrement (en haut), enregistrement de cadre (au milieu) et enregistrement de bande (en bas). De gauche à droite : image fluorescente d'une cellule ganglionnaire rétinienne marquée par YFP ; image en contraste de phase d'un vaisseau sanguin rétinien majeur (veinule); image en contraste de mouvement du vaisseau sanguin ; image de réflectance confocale des capillaires et des faisceaux de fibres nerveuses. c Les profils d'intensité de trois stratégies d'enregistrement dont les emplacements sont marqués par des lignes pointillées blanches en (b). À titre de comparaison, les bandes grises indiquent la largeur des principales caractéristiques de l'image, tandis que les flèches indiquent d'autres caractéristiques mineures. En b, c, l'enregistrement des bandes montre un contraste d'image et un SNR améliorés dans les quatre modalités d'imagerie.

Dans le SLO commercial et l'AOSLO personnalisé, nous avons observé un mouvement oculaire rapide, mais de faible amplitude, qui provoquait une oscillation et un cisaillement intra-image (vidéo supplémentaire 4, 5). De tels effets sont souvent observés dans les appareils à balayage ou ceux dotés d'un "obturateur roulant" lorsque le mouvement dépasse la fréquence d'images de la caméra. Le mouvement n'était pas un artefact du système d'imagerie, car l'effet a été réduit au silence lors de l'administration de l'anesthésie (Vidéo supplémentaire 5). Le mouvement de l'œil dans la direction orthogonale au vaisseau peut être quantifié en suivant la forme du profil de cisaillement (Fig. 6). En utilisant cette approche, nous avons quantifié le mouvement rapide des yeux qui, à notre connaissance, n'a pas été observé chez la souris éveillée (Fig. 6a, b et vidéo supplémentaire 8)15,16. Une transformée de Fourier de la trace du mouvement oculaire (Fig. 6c) a révélé deux pics importants à basse fréquence, respectivement, à 2 et 9 Hz. Ces pics correspondent aux fréquences respiratoires28 et cardiaques29 caractéristiques de la souris éveillée. Cependant, nous avons également observé une bande de puissance dans les régions de fréquence plus élevée au-dessus de 150 Hz. La transformée de Fourier de la trace de la vitesse du mouvement des yeux (Fig. 6d) montre une bande de vitesse proche de 100 Hz avec une bande passante (30 à 150 Hz). Chez les espèces fovéatées, cette bande de fréquence est caractéristique du tremblement oculaire30 ; cependant, il est à noter ici que les souris n'ont pas de fovéa et ont une acuité visuelle de 0,5 c/deg31. L'amplitude du mouvement oculaire à haute fréquence était d'environ 6 µm, ce qui est bien inférieur à la résolution des dispositifs ophtalmiques conventionnels, ce qui peut expliquer pourquoi il a été manqué auparavant.

a Mesure des mouvements oculaires de faible amplitude mais à haute fréquence à l'aide d'une imagerie par balayage linéaire à travers un vaisseau sanguin rétinien majeur (veine). A gauche : image cartésienne de la veine. La flèche noire indique le placement de l'imagerie à balayage linéaire. À droite : image numérisée en ligne de la veine avec une trace de mouvement superposée sous forme de ligne blanche. b En haut : Trace de tremblement oculaire à haute fréquence mise en évidence à l'aide d'un filtre passe-haut (>30 Hz). En bas : trace de la vitesse de déplacement de l'œil. c Transformée de Fourier de la trace du mouvement de l'œil (non filtrée). Des puissances ont été observées jusqu'à 200 Hz. Deux pics de basse fréquence importants ont été observés respectivement à 2 Hz (120 bpm) et 9 Hz (540 bpm), qui peuvent être dus aux battements respiratoires et cardiaques. d Transformée de Fourier de la vitesse de mouvement de l'œil. Une puissance élevée à 30–200 Hz a été observée, indiquant la largeur de bande du tremblement oculaire.

Sous anesthésie, il est rare que l'œil de la souris puisse être imagé pendant plus de 2 h à la fois en raison de la tolérance de l'anesthésie, du développement d'une opacification antérieure ou de la probabilité de récupération après une anesthésie soutenue32,33,34. Par conséquent, la préparation éveillée permet des séances d'imagerie semi-continues qui s'étendent sur plusieurs heures. Pour démontrer cette capacité et cette qualité d'imagerie sur de longs intervalles, la même souris éveillée et se comportant a été imagée pendant 10 heures consécutives avec un intervalle de 1 h (Fig. 7a). Le temps d'imagerie de 10 h couvrait à la fois les périodes normales de veille et de sommeil du cycle circadien lumière-obscurité (les 4 premières heures correspondent aux heures de lumière dans le vivarium et les 6 heures restantes correspondent aux heures d'obscurité). Malgré des changements de regard occasionnels qui modifient naturellement le champ d'imagerie, nous pourrions revenir au même champ imagé avec une précision <3˚ en ajustant manuellement l'orientation de la souris pour assurer la cohérence de chaque session d'imagerie (Fig. 7b et vidéo supplémentaire 7). Pour montrer une telle application, nous avons étudié le mouvement oculaire à haute fréquence en fonction de l'heure de la journée sur 10 h. L'amplitude du mouvement oculaire rapide était constante sur 10 h avec une moyenne de 5, 95 µm ou 10, 50 minutes d'arc (Fig. 7c). Les spectres de puissance du point absolu suggéraient également une bande passante de fréquence cohérente de la vitesse de mouvement (Fig. 7d, e et vidéo supplémentaire 9).

une imagerie AOSLO longitudinale de 10 h chez la même souris éveillée et se comportant avec une tête retenue. L'imagerie a duré 11 h, avec une séance d'imagerie de 10 min toutes les 1 à 1,5 h. Des images AOSLO cartésiennes représentatives de la même veine à chaque session ont été montrées. b Le montage d'images cartésiennes avec des bordures codées par couleur avec des horodatages montre la capacité de naviguer et de se localiser dans la même veine dans différentes sessions d'imagerie sur 10 h. c Amplitude moyenne du tremblement oculaire mesurée à partir des données scannées en ligne de la même veinule sur 10 h. La barre d'erreur indique l'écart type de l'amplitude du mouvement des yeux sur tous les points dans le temps (N = 15 000 lignes). d FT de trace de vitesse de mouvement des yeux montrant des spectres de puissance identiques sur 10 h avec une bande passante constante de 30 à 200 Hz. e Une autre vue en perspective des mêmes données que (d). La ligne grise superposée montre la moyenne de tous les spectres de puissance.

Le mouvement oculaire à haute fréquence a été mesuré chez une souris d'abord à l'état éveillé, puis après l'injection de K/X pendant environ 2 h. Nous avons observé que le mouvement oculaire à haute fréquence était rapidement éliminé après l'induction de l'anesthésie (Fig. 8a, b et vidéo supplémentaire 10). La quantification de cet effet est illustrée à la Fig. 8 ; cependant, l'atténuation visible du mouvement à haute fréquence est également apparente dans la vidéo supplémentaire 5, où les mêmes emplacements rétiniens sont affichés quelques minutes après l'injection de K/X. Le mouvement des yeux était <10 µm sur 80 min, ce qui suggère que non seulement les changements de position du regard sont supprimés, mais également que les mouvements de type tremblement à haute fréquence ont été supprimés. Quatre-vingts minutes après l'injection de K/X, de légères contractions musculaires et battements du visage ont été observés. Les mouvements oculaires rapides et dépendants du regard sont progressivement revenus à des conditions similaires à celles de la ligne de base (Fig. 8c).

a La mesure des mouvements oculaires montre l'absence de mouvements oculaires sous anesthésie profonde, puis réapparaît sous anesthésie peu profonde mais avec une vitesse plus faible par rapport à l'état d'éveil. Le code couleur indique le laps de temps de l'imagerie où le vert est l'état d'éveil, le magenta est l'état d'anesthésie profonde et le cyan est l'état d'anesthésie moins profond. b Profils de vitesse de mouvement des yeux et c Ses spectres de puissance à chaque instant révèlent relativement non seulement une vitesse plus faible, mais également une bande passante de fréquence plus faible sous anesthésie superficielle par rapport à l'état éveillé.

Le débit sanguin a été mesuré en utilisant la technique rapportée précédemment chez les souris à appuie-tête15. En bref, lors de l'exécution d'une imagerie par balayage linéaire à travers un vaisseau sanguin, la cellule sanguine qui coule génère une trajectoire angulaire dans l'image spatio-temporelle, indiquant un changement de position dans le temps mis à l'échelle par l'angle d'incidence du faisceau à travers le vaisseau15. La vitesse des cellules sanguines peut être quantifiée en mesurant la pente des profils de cellules sanguines (Fig. 9a et Fig. S6). Le flux s'est avéré pulsatile (Fig. 9b) mais à des fréquences et des vitesses différentes correspondant à une fréquence cardiaque variable avec anesthésie (481 et 758 Hz chez deux souris éveillées), correspondant à des fréquences cardiaques beaucoup plus élevées35 par rapport à celle mesurée chez des souris anesthésiées ( 271,2 ± 1,2 Hz, n = 5 vaisseaux sanguins de trois souris). Le débit sanguin dans une seule veinule a été réduit de 43 % par rapport à la mesure initiale (1,56 à 0,89 µL/min) 20 min après l'anesthésie (Fig. 9c). Des mesures indépendantes ont montré un rétrécissement brutal du diamètre du vaisseau juste après l'injection de K/X, tandis que le changement de vitesse du sang était mineur au début, mais diminue considérablement au fil du temps après 20 minutes d'injection de K/X. Ces deux paramètres n'ont pas montré de changements équivalents, ce qui souligne l'importance des mesures directes pour révéler une image complète du flux sanguin et de sa régulation36. Alors que le mouvement des yeux (discuté ci-dessus) revient progressivement 80 min après l'induction K/X, le débit sanguin est resté faible (0,66 µL/min), soit 58 % en dessous de la ligne de base. Ces résultats suggèrent que le retour du mouvement oculaire a précédé le retour du flux sanguin rétinien, indiquant que le retour de la fonction physiologique se produit à des rythmes différents chez la même souris après une anesthésie K/X. Les mesures de débit des souris éveillées (n = 5 vaisseaux de trois souris) ont également été comparées aux données précédemment rapportées de notre groupe chez des souris anesthésiées (n = 123 vaisseaux de 20 souris, Fig. 9d)15,19. Malgré les vaisseaux uniques où la vitesse a été réduite sous anesthésie, nous constatons que dans l'ensemble, la relation entre le débit et le diamètre du vaisseau était généralement similaire. Les courbes diamètre-débit du modèle ajusté (détaillées dans les méthodes) montrent des différences globales mineures dans le débit sanguin total.

a Image numérisée en ligne du même gros vaisseau sanguin dans une rétine de souris dans les états d'anesthésie (en haut) et d'éveil (en bas). Les cellules sanguines uniques en circulation détectées ont été étiquetées avec des lignes dont le code couleur représente leurs vitesses. b Vitesses mesurées du flux sanguin des données indiquées en (a). La pulsatile a été observée à la fois dans les données de veille et d'anesthésie. Une fréquence cardiaque et une vitesse d'écoulement plus élevées ont été observées chez la souris éveillée. c Le débit sanguin mesuré dans un vaisseau au fil du temps montre la suppression du débit sanguin sous anesthésie. d Le débit sanguin unicellulaire mesuré chez des souris éveillées (vert, n = 5 vaisseaux, 3 souris) est comparé à une population de souris anesthésiées (violet, n = 123 vaisseaux, 20 souris). Les courbes du modèle de débit-diamètre sont ajustées aux données.

Nous avons mesuré la morphologie rétinienne variée de l'état éveillé à l'état anesthésié en utilisant l'OCT chez quatre souris. Toutes les souris ont été imagées dans le quadrant temporal supérieur de l'œil droit avec un FOV de 30°. Nous avons observé que les souris soumises à l'anesthésie présentaient un épaississement rétinien substantiel sur deux heures, contrairement aux souris à l'état d'éveil (Fig. 10a). L'épaisseur totale de la rétine (TRT) a été quantifiée par un logiciel personnalisé à partir des cubes OCT 3D (Fig. 10b), les mesures de chaque point de données sont présentées sur la Fig. S8. À 80–110 min après l'injection, l'épaisseur de la rétine chez les souris anesthésiées a atteint une augmentation maximale de 8,0 ± 4,1 μm (n = 4 souris) avec un épaississement moyen de 3,9 ± 2,0 % (p = 0,034, Fig. 10c), alors qu'aucun un épaississement a été observé dans les rétines de souris témoins éveillées (p = 0,179, n = 4 souris). L'effet d'épaississement a continué à progresser au dernier moment de la mesure. La carte en face du changement de TRT a également suggéré qu'un tel effet d'épaississement était uniforme dans toutes les régions et excentricités rétiniennes (Fig. 10d, e).

a Imagerie rétinienne de souris OCT longitudinale dans les états éveillé et anesthésié. Un épaississement rétinien a été observé associé au laps de temps post-injection de l'anesthésie K/X. b Épaisseur rétinienne totale (TRT) mesurée à partir des cubes OCT. Il montre un effet épaississant substantiel après 60 min de temps post-injection d'anesthésie KX. c Les mesures de souris N = 4 (Moyenne ± SD) montrent un épaississement significatif lié à l'injection de KX (test t de Student bilatéral). d L'évaluation des changements de TRT par rapport à trois plages d'excentricité sur la rétine ne montre aucune différence significative (ligne noire, moyenne ± SD, N = 4 souris). Les cartes faciales e En du changement de TRT ne montrent également aucune différence locale notable liée aux régions ou aux structures de la rétine.

La préparation de souris à tête retenue facilite un axe optique stable à travers lequel les mesures structurelles et fonctionnelles à l'échelle cellulaire de l'œil de souris éveillé peuvent être imagées avec des modalités d'imagerie ophtalmique standard et haute résolution. La création de cet axe d'imagerie oculaire stable permet toujours la déambulation libre de la souris, ce qui réduit le stress de confinement et permet en outre une passerelle pour les études comportementales et l'interaction visuelle de la souris avec des environnements avec ou sans anesthésie. Cela permet un nouveau domaine de recherche sur la rétine chez la souris qui peut examiner et/ou corriger l'impact de l'anesthésie sur l'imagerie rétinienne, car de nombreuses études ont examiné cet impact dans le cortex5. Pour démontrer un aspect de l'impact de l'anesthésie, nous avons, pour la première fois, caractérisé et comparé les mesures du débit sanguin à la fois à l'état éveillé et anesthésié chez les mêmes souris. En mesurant le débit sanguin rétinien (RBF), nous montrons que le débit sanguin est supprimé par l'anesthésie KX. Cela confirme les preuves d'études précédentes9,37, mais fournit désormais une résolution au niveau du micron, qui est essentielle pour des mesures précises du débit sanguin contenues dans des vaisseaux bien plus petits que 3 à 45 microns chez la souris15. Ce travail est essentiel pour comprendre les fondements du couplage neurovasculaire et de la régulation du flux microvasculaire dans les modèles de maladies qui sont mieux étudiés sans l'impact de l'anesthésie qui peut confondre ou émousser la dynamique et l'état de base. Nous constatons également que l'anesthésie KX induit un épaississement rétinien appréciable tel que mesuré par OCT. À notre connaissance, un tel épaississement progressif n'a pas été rapporté et les mécanismes ne sont pas clairs. Bien que spéculatifs, nous postulons que l'épaisseur rétinienne observée et le changement de RBF peuvent être impactés par des changements de pression intra-oculaire38 qui peuvent être modulés par l'anesthésie KX39. L'anesthésie KX s'est également avérée induire une dépression respiratoire et cardiaque et une diminution de la pression artérielle moyenne, ce qui pourrait induire une modification du RBF40. Bien que des travaux supplémentaires soient nécessaires pour éclairer la nature de ces changements, cette découverte souligne l'importance d'effectuer de telles mesures à l'état éveillé, car l'anesthésie peut fausser l'interprétation des mesures in vivo de la maladie chez la souris, d'autant plus qu'elle peut confondre les interprétations conventionnelles de la rétine. perte/survie des cellules.

Il convient de noter que si les études d'imagerie rétinienne in vivo se sont efforcées de supprimer les mouvements oculaires dans le but d'obtenir une plate-forme d'imagerie stable, cela a pour conséquence de supprimer l'apport naturel à l'œil. Ici, nous reconnaissons que laisser le mouvement oculaire naturel intact offre une chance de mieux comprendre comment le mouvement oculaire et le système visuel fonctionnent ensemble pour fournir la vision de l'organisme41. Pour démontrer un tel exemple, nous montrons l'imagerie active pendant le comportement de regard libre de la souris éveillée. Comme les humains, il existe une préférence temporo-nasale lorsque la souris balaie l'horizon visuel21. Nous constatons également que les souris ont des positions de regard préférées (Fig. 3) malgré l'absence de capacité de fixation normalement attribuée aux mammifères fovéés21. À une échelle plus fine permise par une haute résolution spatio-temporelle AOSLO, nous révélons un mouvement oculaire à haute fréquence et à faible amplitude avec une fréquence temporelle similaire au micro-tremblement oculaire humain (OMT). Provocativement, l'amplitude du mouvement rapide des yeux chez les deux espèces correspond à peu près à la moitié de la taille de l'acuité visuelle maximale rapportée30. Dans d'autres études, il sera intéressant de voir si ce mouvement oculaire pourrait être une caractéristique conservée de la vision des mammifères qui évolue avec la taille du champ réceptif ou l'acuité visuelle. À notre connaissance, il s'agit du premier rapport de ce mouvement à haute fréquence et à faible amplitude chez la souris (Fig. 6). L'intégration de cette entrée visuelle rétinienne dynamique pourrait avoir des conséquences notables pour la caractérisation spatio-temporelle des champs réceptifs visuels chez la souris qui s'étendent de la rétine au cortex42,43,44. Nous montrons qu'un tel mouvement oculaire est maintenu pendant 10 h tout au long du cycle circadien jour/nuit (Fig. 7). Il est important de noter que ce mouvement oculaire à haute fréquence est éliminé avec l'application d'une anesthésie, ce qui est bénéfique pour l'imagerie haute résolution (éliminant le flou de mouvement) ; cependant, supprime également ces informations en tant qu'entrée naturelle pour les stimuli visuels à débit vidéo ou statiques. Une enquête plus approfondie peut révéler une exigence commune de la vision des mammifères pour incorporer un mouvement oculaire intentionnel à cette échelle microscopique pour améliorer le contraste spatio-temporel pour le système visuel30,41. Conformément à cet intérêt, l'impact de la marche a, dans certaines études, indiqué une augmentation apparente de l'acuité visuelle et du gain de réponse de certains neurones visuels associés à la locomotion chez la souris45 qui peuvent maintenant être étudiés au niveau rétinien. Nous considérons également que les mesures d'un tel mouvement oculaire à faible amplitude et haute fréquence pourraient fournir un nouveau biomarqueur utile pour les maladies neurodégénératives dans de nombreux modèles de souris qui cherchent à quantifier l'intégrité des circuits neuronaux responsables du contrôle des mouvements oculaires46. Enfin, il convient de noter qu'au-delà de l'étude de ces mouvements oculaires dans le but de comprendre la fonction et le contrôle neuronaux, la prise en compte et la correction des mouvements oculaires sont essentielles pour obtenir des images haute résolution de la rétine. Non corrigé, il induira un flou de mouvement dans les modalités d'imagerie haute résolution avec des temps d'exposition supérieurs à ~ 5 ms (fréquence d'images de 200 Hz). Et bien que la photographie au flash puisse atténuer un tel flou, il existe à ce jour peu d'ophtalmoscopes d'acquisition vidéo qui atteignent ces vitesses d'imagerie, en particulier pour la souris. Cela signifierait que même à travers une optique parfaite, l'image rétinienne éveillée serait floue sur une échelle de 10 à 20 micromètres. Par conséquent, l'imagerie haute résolution doit atteindre à la fois la correction des aberrations et l'imagerie/enregistrement à grande vitesse> 200 Hz pour atteindre un potentiel limité par la diffraction chez la souris éveillée.

Le renoncement à l'anesthésie présente également un avantage majeur dans l'étude de la physiologie in vivo sur des intervalles de temps plus longs. À ce jour, les études chez la souris se sont concentrées sur l'imagerie rétinienne anesthésiée qui est largement limitée à 30 à 120 min. Cela est dû à l'intolérance à l'anesthésie (mauvaise survie des animaux) ou à la formation transitoire de cataracte lors de l'imagerie pendant de longues périodes. Ici, nous montrons qu'il est possible d'effectuer un protocole d'imagerie semi-continu qui permet l'imagerie du même animal pendant plus de 10 h ou plus. Des enregistrements entièrement continus sont possibles si les bonnes questions scientifiques le justifient ; cependant, des pauses permettant aux animaux de récupérer dans leur cage pour manger, se reposer et dormir sont recommandées. Ce paradigme ouvre une énorme fenêtre temporelle pour sonder finement les défis physiologiques à l'échelle des heures, voire des jours. Par exemple, les changements circadiens, la réponse à la pharmacothérapie, le mouvement des cellules immunitaires36, la modulation glycémique systémique et les régimes d'exercice47 peuvent désormais être étudiés au cours des secondes à quelques heures en une seule séance, et de manière semi-continue pendant des jours sans accumulation de toxicité de l'anesthésie ou complications des opacités antérieures qui ont classiquement limité ce type d'étude nécessitant une anesthésie.

La souris de laboratoire est l'un des modèles les plus populaires utilisés pour récapituler les aspects de la maladie humaine, et ici nous rapprochons le modèle d'un pas de plus pour capturer la physiologie normale de l'œil des mammifères en évitant le besoin d'anesthésie. Pour rendre cette approche disponible à l'échelle mondiale, une solution imprimable en 3D à faible coût est fournie et peut être reproduite dans n'importe quel laboratoire ayant accès à une imprimante 3D et à des pièces du marché libre. Cette conception est destinée à fournir une preuve de concept et à démocratiser des mesures oculaires stables chez la souris sans anesthésie. Il existe une myriade d'applications qui peuvent s'appuyer sur ce travail et qui ont le potentiel de faire progresser notre compréhension des principes fondamentaux de la vision, du comportement, de la structure neuronale, de l'intégrité fonctionnelle et de la physiologie de base de la vision de la souris. Nous nous attendons à ce que certaines des premières applications sondent l'impact de l'anesthésie sur un certain nombre de fonctions physiologiques de base. D'autres peuvent utiliser la résolution et les capacités de suivi rétinien pour améliorer les enregistrements rapides et microscopiques de la position de l'œil dans des environnements visuels libres ou simulés. Nous soutenons que les comparaisons de la physiologie visuelle entre la souris et l'homme sont maintenant encore plus proches en évitant le besoin d'anesthésie qui est rarement utilisé en imagerie ophtalmique clinique. Enfin, la valeur d'une évaluation à long terme d'une durée de plusieurs heures à plusieurs jours permettra un nouveau régime d'étude de la physiologie et de la structure sur une nouvelle fenêtre de temps qui est d'une valeur critique pour la réponse au traitement, les cycles circadiens et les changements plus graduels qui serait autrement manqué en raison des défis logistiques des fenêtres d'imagerie limitées confinées par l'anesthésie. Ensemble, nous nous attendons à ce que cela représente le début de nouvelles études passionnantes dans les études neurales et comportementales chez la souris, l'un des partenaires les plus puissants de la recherche biomédicale.

La tête de la souris était retenue par une pince tenant un bras positionné latéralement de sa plaque de tête en forme de Y implantée chirurgicalement. La plaque de tête a été positionnée verticalement au-dessus d'une roue de course (90 mm de diamètre) de sorte que la souris puisse se déplacer librement avec une posture et une démarche naturelles pendant l'imagerie. Le positionnement latéral de la pince permet également une imagerie réalisable de l'œil controlatéral. La pince se composait de deux pièces imbriquées imprimées en 3D pour créer un ajustement serré autour de la plaque de tête, assurant un appuie-tête stable même s'il n'était tenu que d'un côté. Tous les composants de la plate-forme de roue, à l'exception du roulement et de l'essieu, ont été imprimés en 3D avec des acides polylactiques (Ultimaker, Ultimaker BV, Utrecht, Pays-Bas). Un encodeur rotatif (ENS1J-B28 L00256L, Bourns, Inc, Riverside, Californie, États-Unis) a été fixé à l'axe de roue, leur permettant de tourner en synchronisation. La sortie de l'encodeur a été acquise par une carte d'acquisition de données (USB-6001, National Instruments, Austin, TX, USA). La distance et la vitesse de marche ont été extraites des signaux de sortie de l'encodeur avec MATLAB R2019a (The MathWorks, Inc., Massachusetts, USA). Les données de locomotion ont été synchronisées hors ligne sur la base des horodatages des données d'imagerie acquises simultanément. Les fichiers d'impression 3D et les instructions de montage détaillées sont accessibles publiquement sur "https://github.com/GP-Feng/Awake_Mouse_Imaging_CommBio.git".

Toutes les études animales ont été réalisées conformément aux directives de l'Institut national de la santé et approuvées par le Comité universitaire sur les ressources animales de l'Université de Rochester. Les souris C57BL/6J ont été achetées chez The Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA). Douze souris âgées de 6 à 10 mois ont été utilisées pour des expériences. Tous les animaux ont été hébergés dans l'animalerie de laboratoire The Vivarium du centre médical de l'Université de Rochester selon un cycle lumière-obscurité de 12 et 12 h avec de la nourriture et de l'eau à volonté.

Le protocole de chronologie de l'implantation de la plaque frontale et de la formation des animaux est illustré à la Fig. S1. Une injection sous-cutanée de buprénorphine (0,5–1 mg/kg) a été administrée 24 h avant la chirurgie. Le jour de la chirurgie, les souris ont été pesées, anesthésiées, transférées dans un cadre stéréotaxique pour petit animal (modèle de la série 900, David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA) et fixées avec les barres d'oreille et la barre d'incisive pour un crâne plat. La surface dorsale de la tête a d'abord été rasée, puis la peau a été nettoyée avec un tampon de préparation d'alcool isopropylique à 70 % (numéro de catalogue : MDS090735, Medline, Northfield, IL, États-Unis). Une incision médiane a été pratiquée de la base du crâne à l'os frontal entre les yeux, d'environ 2 à 3 cm de longueur. Ensuite, des incisions latérales ont été faites à l'endroit où le muscle temporal s'insère dans le crâne. Le fascia sus-jacent a été délicatement enlevé par dissection émoussée et irrigation fréquente pour exposer la surface du crâne. Une plaque frontale imprimée en 3D en forme de Y a ensuite été maintenue fermement sur le crâne en appliquant un mélange de ciment dentaire (Jet XR Shadow Powder, Lang Dental, Wheeling, IL, USA) et de colle cyanoacrylate (rapport 2:1) (Krazy Glue Maximum Bond , Krazy Glue, États-Unis). La plaque de tête doit être centrée sur l'intersection de la suture coronale et du bregma, avec un bras médial aligné avec la ligne médiane vers l'os nasal. Les souris ont été placées dans un logement unique avec des maisons en carton pour récupérer pendant 3 jours après la chirurgie. Dans l'ensemble, la santé des souris a été surveillée quotidiennement par l'observation visuelle de l'apparence du pelage et du niveau d'activité. Après la récupération, au moins cinq séances d'entraînement de 30 à 60 minutes ont été effectuées pour acclimater les souris à la plate-forme d'imagerie à tête retenue. Le poids de la souris a été surveillé pour chaque session de formation. Au cours des deux premières séances, les souris ont été légèrement anesthésiées avec un mélange de kétamine-xylazine (100 mg/kg de kétamine et 10 mg/kg de xylazine), puis récupérées avec la tête retenue sur la plate-forme pour permettre la familiarisation. Après récupération, la souris a été autorisée à déambuler pendant 30 à 45 minutes. Ces deux séances d'entraînement ont été effectuées à 24 h d'intervalle pour éviter l'application consécutive d'anesthésie. Trois séances d'entraînement consécutives ou plus de 45 minutes sans aucune anesthésie ont été menées, permettant aux souris de s'acclimater à l'état de l'appuie-tête dans un état pleinement éveillé. Les souris qui affichent une démarche et une posture régulières, ainsi que des caractéristiques comportementales détendues telles que le toilettage, sont considérées comme acclimatées et prêtes pour l'imagerie.

Lors de l'imagerie avec la souris éveillée, aucune procédure supplémentaire n'a été appliquée dans l'œil, à l'exception de la dilatation de la pupille. La dilatation des pupilles a été appliquée à des souris éveillées ou anesthésiées, ce qui a été réalisé en injectant des gouttes oculaires de 1% de tropicamide (Sandoz, Bâle, Suisse) et de 2,5% de phényléphrine (Akorn, Lake Forest, Illinois, USA). L'imagerie a été réalisée dans un environnement sombre avec une phase d'adaptation à l'obscurité de 10 à 15 minutes avant le début de chaque séance d'imagerie. Parce que l'ajustement de l'axe de rotation du rouleau avec la souris était limité dans notre plate-forme, le champ de vision de l'imagerie AOSLO se situait principalement dans le quadrant supérieur de la rétine. Lors de l'imagerie avec des souris anesthésiées, une injection intrapéritonéale d'un mélange de chlorhydrate de kétamine (dosage de 100 mg/kg) et de xylazine (dosage de 10 mg/kg) a été appliquée. Un coussin chauffant externe et un thermomètre à sonde rectale (Physiosuite, Kent) ont été utilisés pour surveiller et maintenir une température corporelle de 37,0 ˚C pour les souris anesthésiées. Pour prévenir l'opacification oculaire induite par la déshydratation sous anesthésie, une lentille de contact (Advanced Vision Technologies, Lakewood, Colorado, USA) a été placée sur l'œil en cours d'imagerie, et une larme artificielle (GenTeal, Alcon Laboratories, Inc, Fort Worth, Texas, USA ) a été appliqué systématiquement toutes les 20 minutes pendant l'imagerie.

L'imagerie SLO et OCT a été réalisée avec une plate-forme commerciale d'imagerie rétinienne multimodale (HRA Spectralis, Heidelberg Engineering, Heidelberg, Allemagne). Les images OCT et SLO ont été capturées avec l'objectif FOV de 30 °, sauf indication contraire. La résolution en pixels de SLO était de 1536 × 1536, tandis que les cubes OCT avaient 1536 × 596 × 97 voxels. Le FOV en face du cube OCT était de 20° × 20° et avec enregistrement à l'aide de la fonction intégrée de suivi rétinien automatisé (ART). Chaque tranche OCT a également été moyennée sur 40 images pour améliorer le SNR.

L'AOSLO multicanal a été décrit dans la littérature précédente14. Il permet l'imagerie rétinienne avec des modalités telles que la réflectance confocale, le contraste de phase et l'imagerie fluorescente. La réflectance confocale et l'imagerie à contraste de phase ont été réalisées avec une diode laser superluminescente de 796 nm avec une bande passante de 17 nm (200–500 µW au niveau de la cornée, S790-GI-15, Superlum, Irlande), tandis qu'une diode laser de 488 nm (220–330 µW au niveau de la cornée, iChrome MLE, Toptica Photonics, Farmington, NY, USA) a été utilisé comme source d'excitation pour l'imagerie fluorescente. Un trou d'épingle ADD 2,1 a été utilisé dans le plan d'image du canal NIR pour la réflectance confocale et l'imagerie à contraste de phase. Pour fournir une imagerie à contraste de phase, le trou d'épingle a été décalé latéralement pour ~ 22 ADD (Guevara, 2020). Un capteur de front d'onde Hartmann – Shack (HSWS) a été appliqué pour mesurer le front d'onde de l'œil de la souris en temps réel. Combiné avec le miroir déformable (DM97-1, ALPAO, Montbonnot-Saint-Martin, France), l'aberration inhérente à l'œil de la souris a été corrigée en boucle fermée.

En se concentrant sur les paupières et le canthus, la pupille de sortie de l'œil de la souris a été imagée à l'aide de NIR SLO à une vitesse de 8,8 ips avec 768 × 768 pixels. L'imagerie a été réalisée chez cinq souris headplate en bonne santé à l'état éveillé. Chaque session d'imagerie a duré environ 20 min et 17 vidéos ont été enregistrées pour la durée maximale autorisée par le système (59,88 s), avec des écarts variant de 5 à 30 s en fonction du temps de mise en mémoire tampon des données entre deux acquisitions. Un algorithme de suivi de la pupille personnalisé écrit en Matlab a été utilisé pour suivre automatiquement la région de la pupille à partir de la vidéo SLO. Une stratégie de segmentation basée sur la texture a été utilisée (Fig. S2). Tout d'abord, un filtre d'écart type (STD) a été appliqué à l'image pour mettre en évidence la région de la pupille, alors que la pupille a une variance spatiale inférieure par rapport aux tissus environnants, tels que la paupière et la fourrure. La carte spatiale STD a ensuite été binarisée avec seuillage (STD <0,25) et la région de la pupille a été segmentée avec un algorithme de bassin versant. Le contour de la zone pupillaire a finalement été équipé d'une fonction elliptique. Des portes logiques ont été définies pour supprimer les faux positifs avec des changements anormalement importants et rapides dans la taille et la position détectées de la pupille. La performance d'appariement de la pupille a été quantifiée comme la zone de chevauchement entre la pupille de sortie segmentée de l'œil de la souris et une pupille d'entrée circulaire virtuelle statique située à la position moyenne de tous les points de données. Lors de l'analyse de la corrélation avec la locomotion de la souris, les données d'appariement des pupilles ont été moyennées sur des intervalles de temps de 1 s pour aligner les données de locomotion enregistrées simultanément.

Les protocoles d'expérience pour la mesure du clignotement et du décalage du regard étaient identiques à la mesure de la pupille, dont la seule différence est que le SLO était focalisé sur la couche de fibres nerveuses de la rétine. Ici, l'événement de clignotement a été détecté sur la base de l'intensité moyenne de l'image des cadres. Une image a été considérée comme subissant un événement clignotant lorsque son intensité d'image est inférieure à 60 % d'intensité d'image moyenne de l'ensemble de la vidéo (Fig. S3). Nous avons implémenté un algorithme de suivi rétinien semi-automatisé écrit en Matlab pour quantifier les décalages globaux pour l'image rétinienne SLO. Trois modèles de référence différents avec des caractéristiques bien définies, telles que les jonctions du disque optique et des vaisseaux sanguins, ont d'abord été sélectionnés manuellement à partir d'une image de référence (Fig. S4a). La taille et les emplacements des modèles ont été déterminés par des utilisateurs expérimentés via une interface utilisateur guidée. Les trois modèles ont été utilisés comme référence pour effectuer une corrélation croisée 2D avec chaque image rétinienne (Fig. S4b). Le décalage rétinien a été déterminé par l'un des trois décalages relatifs extraits de la corrélation croisée 2D, qui a le plus grand coefficient de corrélation normalisé (NCC) (Fig. S4c). Les portes Logit ont été implémentées pour supprimer les points de date en cas de clignotement.

Un algorithme d'enregistrement basé sur des bandes personnalisé signalé précédemment a été utilisé pour corriger la distorsion de mouvement pour les images AOSLO26. En bref, l'image a été séparée en bandes le long de l'axe de balayage lent, et chaque bande a été enregistrée sur l'image de référence individuellement avec une corrélation croisée 2D pour corriger l'effet de cisaillement induit par les mouvements rapides des yeux. Ici, la largeur de la bande sélectionnée était de 32 lignes (équivalent à un taux d'échantillonnage de 468 Hz), ce qui est légèrement supérieur au taux de Nyquist de la bande passante supérieure des mouvements oculaires à haute fréquence (~ 200 Hz). Les bandes enregistrées avec un NCC inférieur à 0,5 ont été considérées comme un "enregistrement d'échec" et supprimées de l'image enregistrée. Pour enregistrer l'image fluorescente, toutes les images ont été convoluées avec un noyau gaussien 2D avec \ (\ sigma = 5 \) pixels avant l'enregistrement afin d'améliorer les performances de corrélation croisée 2D pour les faibles comptages de photons.

Le mouvement oculaire à haute fréquence et à faible amplitude a été mesuré avec AOSLO en balayant un faisceau d'imagerie 1D à travers un vaisseau sanguin rétinien majeur à 15 kHz. Lorsque le mouvement oculaire existe, le profil spatio-temporel imagé du vaisseau sanguin sera cisaillé (Fig. S5a à droite). L'amplitude de la composante de mouvement oculaire orthogonale au vaisseau sanguin \(\left|{{{{{{\boldsymbol{w}}}}}}}_{{{{{\boldsymbol{1}}}}} }}\right|\) peut être extrait comme : \(\left|{{{{{{\boldsymbol{w}}}}}}}_{{{{{\boldsymbol{1}}}}} }}\right|=\left|{{{{{\bf{v}}}}}\right|{{\sin }}(\theta )\), où \(\theta\) est l'angle entre le vaisseau sanguin et l'axe de balayage, et \(\left|{{{{{\bf{v}}}}}}\right|\) est le cisaillement du profil spatio-temporel du vaisseau sanguin (Fig. S5a gauche ). Un algorithme entièrement automatisé a été utilisé pour extraire la trace de cisaillement similaire à l'algorithme d'enregistrement de bande pour la correction de mouvement, mais il n'effectue qu'une corrélation croisée 1D le long de la direction spatiale. Vingt bandes de référence d'une largeur de 32 lignes de balayage ont d'abord été sélectionnées au hasard à partir de l'image spatio-temporelle (Fig. S5b). Une corrélation croisée 1D a été réalisée le long de l'axe de l'espace avec chaque bande de référence pour produire 20 traces candidates, qui ont ensuite été alignées en normalisant les valeurs moyennes. Les points de données décalés dans les tracés candidats présentent des modifications supérieures à 10 pixels par rapport au point temporel précédent, ont été traités comme des faux positifs et ont été exclus de l'analyse future. Enfin, les 20 traces candidates ont été fusionnées en tant que trace de mouvement de sortie finale point par point en calculant la valeur médiane (Fig. S5c). Les traces de mouvement extraites ont été validées par un examen visuel effectué par un utilisateur expérimenté en étudiant les images spatio-temporelles enregistrées (Fig. S5d), les mesures avec une image mal enregistrée ont été considérées comme "échouées" et ont été retirées de l'analyse.

Le débit sanguin unicellulaire a été mesuré de manière non invasive chez des souris éveillées en utilisant une approche qui a été largement décrite dans notre publication précédente15. En bref, les vaisseaux sanguins ont été scannés obliquement en 1D (15 kHz) en gelant le scanner lent (galvo) et les scans consécutifs ont été concaténés dans le temps, pour former une image espace-temps (Fig. S6a). Les cellules sanguines apparaissent sous forme de stries diagonales, indiquant leur position sur le scan. La pente de la strie combinée à l'angle entre la direction du flux et la position de l'analyse 1D (extraite de l'image raster 2D acquise ultérieurement) a été utilisée dans un algorithme automatisé utilisant la transformée de Radon pour extraire la vitesse des cellules sanguines. Dans nos images spatio-temporelles, les stries s'approchant d'une orientation verticale représentent des cellules à vitesse plus élevée. L'algorithme du radon fonctionne en divisant les images spatio-temporelles en ROI qui se chevauchent. Chaque ROI subit une rotation itérative de 180 ° et une projection d'intensité 1D est extraite pour chaque itération. L'écart type a été calculé pour chaque projection 1D et la valeur la plus élevée indique l'angle dominant et donne ainsi une vitesse pour le retour sur investissement. La largeur de bande de mesure de cette technique était de 0, 03 à 1 275 mm / s, ce qui était plus que suffisant pour mesurer les vitesses des cellules sanguines biologiquement possibles dans la rétine de souris éveillée. Le flux pulsatile a été mesuré avec une résolution spatio-temporelle élevée et superposé sous forme de carte de couleur de vitesse sur l'image spatio-temporelle (Fig. S6b). Pour déterminer le diamètre de la lumière du vaisseau, des images de contraste de mouvement du vaisseau sanguin ont été générées à partir d'images cartésiennes 2D. L'imagerie de la lumière vers l'avant et à diffusion multiple à travers la colonne RBC dans des microvaisseaux d'une taille inférieure à 50 µm a permis d'obtenir une mesure précise du diamètre de la lumière. Combinées, les mesures de vitesse et de diamètre ont donné le débit moyen (en µL/min) à travers chaque récipient. Ces mesures ont été effectuées simultanément avec celles des mouvements oculaires décrites dans la section ci-dessus. Les courbes du modèle de débit-diamètre ont été ajustées aux données mesurées par rapport aux deux populations. Brièvement, le modèle utilisé était de la forme y = axb. où y est le débit (µL/min) et x est le diamètre (µm).

La mesure de l'épaisseur rétinienne a été réalisée avec HRA OCT. Le mode "Suivi" a été utilisé pour effectuer une imagerie longitudinale au même endroit de la rétine avec le premier point dans le temps comme référence. L'épaisseur rétinienne totale (TRT) a été définie comme la distance entre la limite vitreuse-membrane limitante interne (vitrée-ILM) et la limite segment externe-épithélium pigmentaire rétinien (OS-RPE) (Fig. S7a, b). Une région circulaire centrée sur le disque optique avec un degré visuel de 8 °, difficile à segmenter, a été masquée dans l'analyse (Fig. S7c). Les couches ont été détectées par un algorithme personnalisé de segmentation de programmation dynamique-théorie des graphes basé sur la stratégie précédemment rapportée par la réf. 48.

Toutes les données de la présente étude provenaient de 12 souris sur le fond C57BL/6 J du stock Jackson Labs (Bar Harbor, ME) (CX3Cr1, thy-1 YFP, stock B6). Les souris ont été imagées directement à partir des laboratoires de Jackson ou dans quelques générations de descendants de la colonie des souris fondatrices d'origine. Toutes les mesures de l'étude ont été effectuées soit plusieurs fois chez la même souris (par exemple, Figs. 2–4, 6–9) soit sur plusieurs souris à des fins de comparaison. Lors de la comparaison entre deux moments ou groupes différents, les différences ont été évaluées sur la base d'un simple test t apparié pour comparer les conditions. Des tests statistiques ont été effectués dans Matlab® et rapportés avec le seuil de signification répondant aux valeurs p *p < 0,1, **p < 0,05. Les valeurs p réelles sont rapportées.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données sources derrière les chiffres sont incluses dans les fichiers de données supplémentaires 1 à 7. Les données SLO traitées et les vidéos AOSLO et OCT brutes sont disponibles dans un référentiel public (Zenodo) : https://doi.org/10.5281/zenodo.7806898. Des données supplémentaires sont disponibles auprès des auteurs sur demande raisonnable.

Les fichiers d'impression 3D de la configuration de la souris à tête retenue et tous les codes de traitement des données sont disponibles dans le référentiel public (GitHub) : https://github.com/GP-Feng/Awake_Mouse_Imaging_CommBio.

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Le laboratoire Schallek est soutenu par le National Eye Institute des National Institutes of Health sous R01 EY028293 et ​​P30 EY001319. Padmanabhan est soutenu par des subventions des National Institutes of Health R01 MH113924, P50 HD103536 et de la National Science Foundation (NSF) CAREER 1749772. La recherche a également été soutenue par une subvention sans restriction au département d'ophtalmologie de l'Université de Rochester, un prix de développement de carrière, un Career Advancement Award et un Stein Award de Research to Prevent Blindness (RPB), New York, New York; le Dana Foundation David Mahoney Neuroimaging Award et une bourse de recherche de Genentech Inc. (Schallek).

Département de génie biomédical, Université de Rochester, Rochester, NY, 14620, États-Unis

Guanping Feng & Kosha Dholakia

Centre des sciences visuelles, Université de Rochester, Rochester, NY, 14627, États-Unis

Guanping Feng, Aby Joseph, Kosha Dholakia, Fei Shang, Charles W. Pfeifer, Derek Power, Krishnan Padmanabhan et Jesse Schallek

L'Institut d'optique, Université de Rochester, Rochester, NY, 14620, États-Unis

Pour que Joseph

Département de neurosciences, Université de Rochester, Rochester, NY, 14642, États-Unis

Fei Shang, Krishnan Padmanabhan et Jesse Schallek

Flaum Eye Institute, Université de Rochester, Rochester, NY, 14642, États-Unis

Charles W. Pfeifer et Jesse Schallek

Centre de recherche sur les déficiences intellectuelles et développementales, Université de Rochester, Rochester, NY, 14642, États-Unis

Krishnan Padmanabhan

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JS a conçu cette étude. KP a fourni l'idée et la conception de la préparation et de la configuration de la souris à tête retenue. GF, AJ, KD, FS, CWP, DP et JS ont conçu et réalisé des expériences. GF, AJ et FS ont analysé et interprété les données. GF, AJ, KD, FS, DP et JS ont rédigé le manuscrit. Tous les auteurs ont relu et corrigé le manuscrit.

Correspondance à Jesse Schallek.

Le laboratoire a été soutenu en partie par une subvention de recherche collaborative de Genentech Inc. Jesse Schallek détient des brevets américains sur la technologie d'imagerie ophtalmique détenus par l'Université de Rochester. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Thomas J. Gast et l'autre examinateur, anonyme, pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef de la gestion principale : Joao Valente. Un dossier d'examen par les pairs est disponible.

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Réimpressions et autorisations

Feng, G., Joseph, A., Dholakia, K. et al. Imagerie rétinienne structurelle et fonctionnelle à haute résolution chez la souris éveillée. Commun Biol 6, 572 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04896-x

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Reçu : 18 mai 2022

Accepté : 02 mai 2023

Publié: 29 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04896-x

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